RUBRICA SPECIALISTULUI

Inhibitorii de N-glicani în metodele de imunoanaliză pentru IgE alergen-specifice serice

 N-Glycan Inhibitors in Immunoassay Methods for serum Allergen Specific IgE

First published: 31 martie 2020

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Aler.4.1.2020.2983

Abstract

Cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs) represent fucosylated/xylosylated N-glycans present in pollen and food of plant origin, latex and hymenoptera venoms. IgE antibodies against CCD do not have significant clinical relevance, but represent an important cause of cross-reactivity in the case of in vitro immunoassay methods for determining serum specific IgE. CCD inhibitors play a key role in the laboratory for preventing misinterpretation of such in vitro positive assays and for increasing their specificity.

 

Keywords
cross-reactive carbohydrate determinants, N-glycan inhibitors, IgE immunoassay

Rezumat

Determinanţii carbohidraţi cu reactivitate încrucişată/cross-reactivi (CCD) reprezintă N-glicani fucozilaţi/xilozilaţi prezenţi în polenuri şi alimente de origine vegetală, latex şi veninuri de himenoptere. Anticorpii IgE faţă de CCD nu au relevanţă clinică semnificativă, dar reprezintă o cauză importantă de reactivitate încrucişată în cazul metodelor de imunoanaliză in vitro pentru determinarea IgE specifice serice. Inhibitorii CCD utilizaţi în laborator au un rol-cheie pentru a evita interpretarea greşită ca pozitivă a unor astfel de teste in vitro şi cresc specificitatea lor.

 

Determinanţii carbohidraţi cu reactivitate încrucişată/cross-reactivi (Cross-reactive Carbohydrate Determinants, CCD) reprezintă N-glicani care sunt oligozaharide legate de asparagină, având miez cu a(1→3)-fucoză şi/sau b(1→2)-xiloză, ca urmare a modificărilor posttranslaţionale comune ale unor glicoproteine din plante, insecte şi alte nevertebrate(1). N-glicanii constituie un grup cu diversitate mare de oligozaharide legate prin asparagină la glicoproteinele eukariotelor, fiind implicaţi în plierea, stabilitatea, traficul intracelular, secreţia şi funcţionarea proteinelor(2).

Termenii de „cross-reactivitate“ (reactivitate încrucişată) şi „cross-reactiv“ (cu reactivitate încrucişată) sunt cuvinte de origine engleză împrumutate în limba română (anglicisme) şi recent integrate în limbajul de specialitate ca neologisme, fiind utilizaţi în documente oficiale ale Ministerului Sănătăţii (MS), inclusiv în documentele pentru curriculumul de pregătire în specialitatea alergologie şi imunologie clinică, şi ale Ordinului Biochimiştilor, Biologilor şi Chimiştilor în Sistemul Sanitar din România (OBBCSSR)(3,4). Similar, în limba italiană, termenul „cross-reattività“ (reattività crociata) este utilizat în documente de pe paginile online oficiale ale Societăţii Italiene de Alergologie, Astm şi Imunologie Clinică (Societa’ Italiana di Allergologia, Asma ed Immunologia Clinica, SIAAIC) şi ale Societăţii Italiene de Alergologie şi Imunologie Pediatrică (Società Italiana di Allergologia e Immunologia Pediatrica, SIAIP)(5,6).

Termenul de determinant carbohidrat cross-reactiv (CCD) a fost folosit prima dată în 1981, când s-a constatat că anticorpii IgE din anumite seruri umane reacţionează cu antigene prezente într-un număr mare de alimente de origine vegetală neînrudite, precum arahide, cartof, spanac, făină de grâu, orez, antigenele existând, de asemenea, şi în grăuncioarele de polen. Anticorpii au reacţionat in vitro, surprinzător, şi cu veninul de albină şi viespe şi au fost uneori induşi de înţepăturile de himenoptere(7).

Cele mai multe extracte alergenice naturale provenite din plante sau venin de insecte conţin CCD, dar CCD nu se comportă ca alergene in vivo şi nu au semnificaţie relevantă clinic(8-12). Inducerea anticorpilor IgE faţă de CCD la om se consideră că este determinată de expunerea la polen şi/sau de înţepăturile de insecte(13).

Anticorpii de tip IgE faţă de CCD reacţionează încrucişat cu toate proteinele care conţin astfel de epitopi CCD, de aceea reprezintă o cauză importantă de reactivitate încrucişată în cazul metodelor de imunoanaliză in vitro pentru determinarea IgE specifice serice faţă de alergene de origine vegetală care conţin CCD. Anticorpii IgE anti-CCD sunt detectaţi la până la 25% dintre pacienţii alergici, dar în general nu au nicio relevanţă clinică în comparaţie cu anticorpii IgE faţă de regiunile proteice specifice. Deoarece mulţi pacienţi au anticorpi IgE anti-CCD nerelevanţi clinic, un număr semnificativ de rezultate ale metodelor de imunoanaliză pentru IgE specifice serice sunt interpretate ca pozitive, dacă nu se utilizează inhibitor CCD. Prezenţa IgE anti-CCD poate deruta evaluarea reactivităţii in vitro în cazul în care se utilizează extracte naturale sau glicoproteine purificate care conţin CCD, cum ar fi cele din polenuri, alimente de origine vegetală, latex sau veninuri de himenoptere(11,14-17).

Mai multe componente alergenice naturale purificate utilizate în diagnosticul molecular alergologic prin imunoanaliză bazată pe nanotehnologie cu alergene cuplate cu nanoparticule şi interpretare prietenoasă pentru pacient (patient-friendly allergen nano-bead array) conţin CCD: expansina nLol p 1 din polen de graminee zâzanie sau raigras (Lolium perenne), nOle e 1 din polen de măslin (Olea europaea), pectat liaza nCup a 1 din polen de chiparos de Arizona (Cupressus arizonica), patatina nSola t 1 din tubercul de cartof (Solanum tuberosum), globulina 7S de tip vicilină nAra h 1 din arahidă (Arachis hypogaea), vicilina sau globulina 7S Jug r 2 din nucă (Juglans regia), fosfolipaza A2 nApi m 1 din venin de albină (Apis melifera), tipic peroxidaza de hrean (Armoracia rusticana) nArm r HRP (horseradish peroxidase) şi cistein proteaza nAna c 2 din tulpină şi fruct de ananas (Ananas comosus)(18).

nAna c 2 (nMUXF3) este un N-glican purificat din bromelaina provenită din tulpina de ananas (Ananas comosus) capabil să detecteze IgE faţă de N-glicani din cele mai multe surse vegetale. Prescurtările din structura glicanului sunt: manoza (M), manoza nesubstituită central (U), xiloza (X) şi fucoza (F). IgE serice anti-CCD sunt un biomarker de reactivitate faţă de fragmente de tip carbohidrat ale glicoproteinelor(11,16,17).

Proteinele recombinate produse în Escherichia coli nu sunt afectate de recunoaşterea CCD, datorită pierderii glicozilării posttranslaţionale a proteinelor(19). Cu toate acestea, metodele de imunoanaliză singleplex pentru IgE cu alergene recombinate, care utilizează celuloza, pot furniza rezultate fals-pozitive de până la 2 kUA/L în serurile intens pozitive pentru CCD, ca urmare a prezenţei reziduurilor de glicoproteine cu CCD în matricea de celuloză. Polimerul celulozic capsulat din imunoanaliza fluoroenzimatică în fază solidă conţine mici cantităţi reziduale de CCD, suficiente pentru a produce legare de fond în serurile cu nivel ridicat de IgE anti-CCD. Acest fapt poate induce rezultate pozitive chiar şi la alergene recombinate neglicozilate la 2-3% din serurile pacienţilor atopici(20).

Determinarea IgE anti-CCD folosind un identificator de tip MUXF fixat la faza solidă este utilă, dar nu poate discrimina între rezultatele fals-pozitive şi cele cu adevărat pozitive(15).

Eliminarea IgE anti-CCD cu CCD imobilizate a fost de asemenea sugerată, dar neaplicată, fiind considerată prea laborioasă pentru a fi utilizată de rutină(9,21).

În cercetarea ştiinţifică a fost utilizată şi distrugerea epitopilor de carbohidraţi prin tratament cu periodat. Din păcate, conformaţia proteică poate fi modificată de acest tratament, ceea ce provoacă reducerea sensibilităţii şi rezultate fals-negative. Prin urmare, oxidarea prin periodat nu este aplicată în testele de imunoanaliză disponibile comercial pentru determinarea IgE specifice(1).

Una dintre soluţiile practice pentru a evita rezultate fals-pozitive datorate IgE anti-CCD în cazul metodelor de imunoanaliză pentru determinarea IgE specifice serice poate fi adăugarea unui exces de glicoconjugate care să competiţioneze cu legarea anticorpilor anti-CCD, dar, surprinzător, această soluţie nu a fost aplicată de rutină în laboratorul de alergologie şi imunologie clinică, chiar dacă glicoproteinele naturale din plante, cum ar fi peroxidaza de hrean sau ascorbat oxidaza, au fost alegeri evidente(15).

Un inhibitor de N-glican CCD, semisintetic, de primă generaţie, constă din glicopeptide din bromelaină (din tulpină de ananas) legate cu albumină serică bovină (MUXF-BSA)(22).

Un inhibitor potent CCD de a doua generaţie a fost creat ca un conjugat glicopeptid-albumină serică umană (HSA), pentru care glicopeptidele vegetale au fost supuse unei scheme riguroase de purificare, iar polimerul transportor este albumina umană. Astfel de glicopeptide care conţin maximum patru reziduuri de aminoacizi sunt purificate din bromelaină ca glicoproteină vegetală şi cuplate la albumina serică umană în proporţie de cel puţin 7 la 1. Această abordare asigură absenţa epitopilor pentru IgE pe bază de proteine şi, prin urmare, specificitate maximă. Măsurile de control al calităţii prin spectrometrie de masă asigură calitatea constantă a produsului. Doza recomandată este de 2 volume de blocant CCD la 100 de volume de ser – sau, altfel spus, 20 µL de blocant CCD pentru fiecare mL de ser. Inhibitorul CCD şi serul pacientului se amestecă corect înainte de prelucrarea ulterioară, cu etapă de preincubare scurtă. Astfel de inhibitor de N-glican CCD este disponibil sub formă de pulbere liofilizată, care la dizolvarea în apă realizează concentraţie de 1 mg/mL inhibitor într-un tampon slab de acetat de amoniu. Există şi imunoanaliză multiplex care integrează inhibitor CCD în diluentul probelor. Utilizarea inhibitorilor de N-glicani CCD poate fi aplicată în metode de imunoanaliză pentru IgE specifice de tip singleplex, multiparametric şi multiplex(1,15,17,22,23).

Referitor la recunoaşterea alergenelor într-un sistem de imunoanaliză in vitro, acelaşi alergen cu un epitop glican şi un epitop peptidil poate conduce la rezultat pozitiv în trei situaţii diferite. Dacă serul de testat conţine doar anticorpi IgE specifici pentru N-glican (anticorpi IgE anti-CCD), rezultatul este fals-pozitiv şi se datorează CCD, dacă serul conţine doar anticorpi IgE specifici peptidelor, rezultatul este pozitiv real şi se datorează sensibilizării peptidice, iar dacă serul de testat conţine anticorpi IgE faţă de peptide şi glicani, rezultatul pozitiv incert este datorat unei sensibilizări mediate IgE faţă de peptide cu semnal amplificat din cauza anticorpilor IgE anti-CCD. Problema CCD poate fi mai puţin perceptibilă în cazul imunoanalizelor singleplex cu indicaţie ghidată anamnestic, dar exercită efect confuzionant mai amplu în cazul sistemelor de imunoanaliză cu alergene multiple evaluate concomitent(23).

Într-o metodă de imunoanaliză multiparametrică pentru diagnostic in vitro cu extracte alergenice naturale şi componente alergenice purificate caracterizate biochimic, acoperind benzi în linii subţiri paralele de tip line-blot, pentru a preveni potenţiale rezultate fals-pozitive ale testelor datorate IgE anti-CCD, anticorpii cu reactivitate încrucişată din eşantionul pacientului pot fi eliminaţi prin legare prealabilă a unui absorbant anti-CCD(24).

O altă analiză imunoenzimatică multiparametrică cu extracte naturale şi componente alergenice care acoperă o membrană fixată în casete utilizează inhibitor de N-glican compus din structuri CCD polivalente de bromelaină, cu mai puţin de patru aminoacizi rămaşi după proteoliză şi purificare, ceea ce garantează lipsa epitopilor peptidici. Glicopeptidul astfel obţinut este ataşat la proteina transportor, care este albumina serică umană extrem de purificată(25).

Imunoanaliza multiplex în fază solidă bazată pe nanotehnologie de tip macroarray utilizată ca explorator de alergologie moleculară (macroarray nanotechnology-based immunoassay as a molecular allergy explorer), introdusă recent în laboratorul de alergologie şi imunologie clinică, integrează inhibitor CCD potent în timpul incubării serului(17,26). Acest conjugat glicopeptid-HSA reduce dificultatea interpretării de către medicii alergologi clinicieni a rezultatelor in vitro CCD pozitive şi creşte specificitatea rezultatelor testului. Un astfel de test in vitro de generaţie nouă pentru alergiile mediate IgE are un panel extins de peste 290 de alergene, cu extracte alergenice naturale şi alergene moleculare native (n) sau recombinate (r), completat de determinarea concomitentă a IgE totale. Diferitele extracte şi componente alergenice moleculare sunt disponibile pe membrană de nitroceluloză în cipul din cartuş. La fiecare cartuş se adaugă 400 µL de diluent de probă care include inhibitorul CCD şi se adaugă 100 µL din proba pacientului, asigurându-se că soluţia rezultată este răspândită uniform. Incubarea serului se efectuează timp de 2 ore. Lactoferina umană Hom s LF este o proteină cu CCD care poate fi utilizată pentru evaluarea eficacităţii inhibitorului CCD. Cu procedura standard de inhibare a CCD, eficienţa inhibării anticorpilor anti-CCD este de 85%. O etapă suplimentară de inhibare a CCD conduce la o rată de inhibare a acestor anticorpi de peste 95%(26-29).

Concluzii

Interferenţele analitice datorate IgE anti-CCD pot afecta rezultatele metodelor imunologice pentru determinarea IgE specifice serice faţă de polenuri, alimente de origine vegetală, latex sau veninuri de himenoptere, de aceea inhibitorii de CCD ca N-glicani fucozilaţi şi/sau xilozilaţi utilizaţi în laborator au un rol-cheie pentru a evita interpretarea greşită ca pozitive a rezultatelor unor astfel de teste in vitro pentru a creşte specificitatea lor.

Bibliografie

  1. Hemmer W. Human IgE antibodies against Cross-Reactive Carbohydrate Determinants. In: Anticarbohydrate antibodies: from molecular basis to clinical application. Kosma P, Muller-Loennies S. (eds). Springer. Wien New York. 2012, 191-203.
  2. Lannoo N, Van Damme EJ. Review/N-glycans: The making of a varied toolbox. Plant Sci. 2015; 239: 67-83.
  3. www.ms.ro/wp-content/uploads/2016/12/Alergologie-si-imunologie-clinica.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2019).
  4. www.obbcssr.ro/files/6._D.Popa_Rolul_Specialistului_OBBCSSR_2018.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2019).
  5. www.siaaic.org/?p=3799 (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  6. www.siaip.it/upload/riap/1482_Le%20reazioni%20di%20ipersensibilita%20agli%20antibiotici%20beta-lattam (accesare online la data de 13 ianuarie 2019).
  7. Aalberse RC, Koshte V, Clemens JG. Immunoglobulin E antibodies that crossreact with vegetable foods, pollen, and Hymenoptera venom. J Allergy Clin Immunol. 1981; 68(5):356-64.
  8. van der Veen MJ, van Ree R, Aalberse RC, Akkerdaas J, Koppelman SJ, Jansen HM, van der Zee JS. Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohydrate determinants of glycoproteins. J Allergy Clin Immunol. 1997; 100(3):327-34.
  9. Malandain H, Giroux F, Cano Y. The influence of carbohydrate structures present in common allergen sources on specific IgE results. Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2007; 39: 216-220.
  10. Mari A, Ooievaar-de Heer P, Scala E, Giani M, Pirrotta L, Zuidmeer L, Bethell D, van Ree R. Evaluation by double-blind placebo-controlled oral challenge of the clinical relevance of IgE antibodies against plant glycans. Allergy. 2008; 63(7):891-6.
  11. Altmann F. Coping with cross-reactive carbohydrate determinants in allergy diagnosis. Allergo J Int. 2016; 25(4): 98-105.
  12. Mahler V, Gutgesell C, Valenta R, Fuchs T. Natural rubber latex and hymenoptera venoms share Immunoglobin E-epitopes accounting for cross-reactive carbohydrate determinants. Clin Exp Allergy. 2006; 36(11): 1446-56.
  13. Matricardi PM, Kleine-Tebbe J, Hoffmann HJ, Valenta R, Hilger C, Hofmaier S, Aalberse RC, Agache I, Asero R, Ballmer-Weber B, Barber D, Beyer K, Biedermann T, Bilò MB, Blank S, Bohle B, Bosshard PP, Breiteneder H, Brough HA, Caraballo L, Caubet JC, Crameri R, Davies JM, Douladiris N, Ebisawa M, EIgenmann PA, Fernandez-Rivas M, Ferreira F, Gadermaier G, Glatz M, Hamilton RG, Hawranek T, Hellings P, Hoffmann-Sommergruber K, Jakob T, Jappe U, Jutel M, Kamath SD, Knol EF, Korosec P, Kuehn A, Lack G, Lopata AL, Mäkelä M, Morisset M, Niederberger V, NowakWęgrzyn AH, Papadopoulos NG, Pastorello EA, Pauli G, PlattsMills T, Posa D, Poulsen LK, Raulf M, Sastre J, Scala E, Schmid JM, Schmid-Grendelmeier P, van Hage M, van Ree R, Vieths S, Weber R, Wickman M, Muraro A, Ollert M. EAACI Molecular Allergology User’s Guide. Pediatr Allergy Immunol. 2016; 27 Suppl 23: 1-250.
  14. Mari A. IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the distribution and appraisal of the in vivo and in vitro reactivity. Int Arch Allergy Immunol. 2002; 129: 286-295.
  15. Holzweber F, Svehla E, Fellner W, Dalik T, Stubler S, Hemmer W, Altmann F. Inhibition of IgE binding to cross-reactive carbohydrate determinants enhances diagnostic selectivity. Allergy. 2013; 68: 1269-1277.
  16. Altmann F. The role of protein glycosylation in allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2007; 142: 99.
  17. Popescu FD, Vieru M. Precision medicine allergy immunoassay methods for assessing immunoglobulin E sensitization to aeroallergen molecules. World J Methodol. 2018; 8(3):17-36.
  18. www.caam-allergy.com/pdf/Green_John_IgE_Multiplex_FABER244_ENG.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  19. Demain AL, Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 2009; 27: 297-306.
  20. Hemmer W, Altmann F, Holzweber F, Gruber C, Wantke F, Wöhrl S. ImmunoCAP cellulose displays cross-reactive carbohydrate determinant (CCD) epitopes and can cause false-positive test results in patients with high anti-CCD IgE antibody levels.J Allergy Clin Immunol. 2018; 141(1): 372-381.
  21. Jin C, Nitsch S, Hemmer W, Altmann F. Improving allergy diagnosis by removal of CCD-specific IgE from patients' sera. Allergy 2009; 64(Suppl. 90):30.
  22. www.proglycan.com/allergy-diagnosis/proglycan-ccd-blocker/how-it-works (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  23. https://mediwiss-analytic.de/ccd.html (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  24. www.euroimmunblog.com/cross-reactive-anti-ccd-antibodies-can-hinder-allergy-diagnostics (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  25. Grzywnowicz M, Majsiak E, Gaweł J, Miśkiewicz K, Doniec Z, Kurzawa R. Inhibition of Cross-Reactive Carbohydrate Determinants in allergy diagnostics. Adv Exp Med Biol. 2018; 1116: 75-79.
  26. Heffler E, Puggioni F, Peveri S, Montagni M, Canonica GW, Melioli G. Extended IgE profile based on an allergen macroarray: a novel tool for precision medicine in allergy diagnosis. World Allergy Organ J. 2018; 11(1):7.
  27. https://a.storyblok.com/f/69176/x/81f1990ace/alex2_allergen_list_en.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  28. www.macroarraydx.com (accesare online la data de 13 ianuarie 2020).
  29. ALEX (Allergy Explorer) Instruction for use. 20170821_RZ_ALEX_Gebrauchsanweisung_EN.indd