SUPLIMENT FITOTERAPIE

Surse de antioxidanţi naturali cu rol benefic în tratamentul diabetului zaharat de tip II

 Sources of natural antioxidants with beneficial role in the treatment of type II diabetes

First published: 06 aprilie 2015

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/FARM.5.2.2015.4494

Abstract

Oxidative stress plays a major role in diabetes mellitus pathology and represents the hallmark of its future complications (stroke, cardiovascular artery disease, retinophaty, nefropathy). The aim of our study was the determination of phenolic compounds and mineral elements from a raspberry leaf (Rubi idaei folium extractum) dry extract and the evaluation of its protective role in endothelial cells exposed to oxidative stress. The active substances content was assesed by means of spectrophotometric and spectrometric methods. The dry extract was standardized in phenolic compounds and mineral elements (magnesium, zinc, chromium, manganese). It showed a protective effect upon endothelial cells in a narrow concentration range (0.005-0.05 mg/mL). Raspberry leaf dry extract represents a new vegetal source with a benefic role towards diabetes mellitus type II endothelial dysfunction.
 

Keywords
endothelial cells, phenolic compounds, oxidative stress

Rezumat

Stresul oxidativ reprezintă un factor-cheie în patologia diabetului zaharat şi a complicaţiilor acestuia la nivel macro- (boală coronariană, accident vascular cerebral) şi microvascular (nefropatie, retinopatie). Obiectivul cercetării a constat în determinarea conţinutului în constituenţi naturali cu rol antioxidant (polifenoli totali, elemente minerale) al unui extract uscat obţinut din frunze de zmeur (Rubi idaei folium extractum) şi evaluarea efectului citoprotector asupra celulelor endoteliale, în condiţii de stres oxidativ. Pentru determinarea conţinutului în principii active s-au utilizat metode spectrofotometrice şi spectrometrice. Efectul citoprotector a fost evaluat pe baza viabilităţii celulare. Extractul uscat a fost standardizat în constituenţi fenolici şi elemente minerale (zinc, magneziu, mangan, crom) şi a protejat celulele endoteliale la concentraţii de 0,005-0,05 mg/mL. Rubi idaei folium extractum reprezintă o nouă sursă vegetală indigenă, cu rol benefic în tratamentul disfuncţiei endoteliale, caracteristică diabetului zaharat de tip II.
 

Introducere

Speciile reactive de oxigen (SRO), ce includ atât radicali liberi (hidroxil - OH•, superoxid - O2•, peroxil - RO2•), cât şi molecule non-radicalice (apă oxigenată - H2O2, acid hipocloros - HOCl), se formează constant în organism în urma unor procese biologice sau a răspunsului la stimuli nocivi (poluare, radiaţii, fum de ţigară). Anihilarea acestor molecule se realizează prin intermediul sistemelor antioxidante endogene reprezentate de glutation, vitamina E, oligoelemente (seleniu, mangan, zinc) şi enzime (catalază, superoxid-dismutază, glutationperoxidază, glutationreductază)(1).

Supraproducţia de radicali liberi şi incapacitatea sistemelor antioxidante de a contracara acţiunile nocive ale acestora la nivel molecular conduc la apariţia stresului oxidativ, al cărui rol în patologia afecţiunilor metabolice (sindrom metabolic, diabet zaharat, dislipidemie) reprezintă un domeniu de interes actual(1).

Diabetul zaharat este o afecţiune gravă, cu repercusiuni asupra metabolismului glucidic, lipidic şi proteic, ce evoluează cu numeroase complicaţii la nivel macro- (accident vascular cerebral, boală coronariană) şi microvascular (angiopatie, nefropatie, retinopatie), fiind răspunzător de aproximativ 6,8% din totalul deceselor globale(2). Hiperglicemia şi rezistenţa la insulină participă la creşterea producţiei de SRO prin: activarea căii poliolilor, creşterea sintezei de compuşi finali de glicozilare (AGE), activarea proteinkinazei C şi creşterea producţiei de anionsuperoxid la nivel mitocondrial. Afectarea endoteliului vascular din cauza hiperglicemiei, hiperlipemiei şi a producţiei de AGE reprezintă principalul factor de risc în apariţia bolii coronariene la pacienţii diabetici(3).

Cercetări recente au evidenţiat rolul important al polifenolilor (acizi polifenolcarboxilici = APFC, flavone, taninuri, proantociani) în patologia diabetului zaharat de tip II (DZ II), prin scăderea rezistenţei la insulină, rol antiinflamator, antioxidant şi hipolipemiant(4).

Dintre produsele vegetale indigene, frunzele de zmeur (Rubi idaei folium) reprezintă o sursă importantă de constituenţi fenolici: flavone (quercetol-3-O-rutinozida = rutozidă - 52-236 mg/kg; quercetol-3-O-galactozidă = hiperozidă - 34-720 mg/kg, kaempferol-3-O-glucozidă = astragalină), acizi polifenolcarboxilici (clorogenic, cafeic, ferulic, gentisic, elagic), elagotaninuri (lambertianin C, D, sanguiin H6) şi proantociani. În compoziţia frunzelor se mai întâlnesc şi steroli (stigmasterol, sitosterol), vitamina C, elemente minerale (seleniu, vanadiu)(5-6).

Obiectivele cercetării au constat în: determinarea conţinutului în polifenoli, elemente minerale ale unui extract uscat obţinut din frunze de zmeur şi evaluarea efectului citoprotector asupra celulelor endoteliale EAhy926 supuse stresului oxidativ în prezenţa apei oxigenate şi a sulfatului feros (cu generarea radicalilor hidroxil - OH·în urma reacţiei Fenton). Întrucât se doreşte valorificarea terapeutică a extractului, s-a urmărit şi stabilitatea acestuia pe durata a 12 luni, prin determinarea conţinutului în polifenoli, ce pot suferi cu uşurinţă reacţii de oxidare sau polimerizare.

Material şi metode

Material

S-a utilizat un extract hidroalcoolic uscat, obţinut din Rubi idaei folium prin liofilizare.

Reactivi şi solvenţi utilizaţi

Toţi reactivii provin de la firma Roth (Germania), cu excepţia mediului de cultură DMEM, a sulfatului feros, a bromurii de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium = MTT, care au fost procuraţi de la Sigma-Aldrich (Germania). Serul fetal bovin este de provenienţă EuroClone (Italia), iar linia celulară EAhy926 a fost achiziţionată de la LGC Standards (UK).

Cromatografia în strat subţire (CSS)

Analiza CSS a fost efectuată utilizând plăci de silicagel (10 x 10 cm, Merck), ce au fost activate o oră la 105°C, înainte de utilizare. Ca faze mobile s-au utilizat următoarele sisteme: acetat de etil: acid formic: apă = 80:8:12 (v/v/v) (faza mobilă I - pentru identificarea flavonelor şi APFC) şi toluen: dioxan: acid acetic glacial = 90:25:4 (v/v/v) (faza mobilă II - pentru identificarea agliconilor flavonici şi APFC). Probele au constat în soluţie 5% extract (obţinută în etanol 20% - soluţie E) ca atare şi supusă hidrolizei cu HCl 2N (timp de 60 de minute), urmată de extracţia cu solvent organic apolar (eter etilic - soluţia EH). Ca substanţe de referinţă s-au utilizat soluţii metanolice 0,1 mg/mL de rutozidă, hiperozidă, quercitrozidă, quercetol, kaempferol, acid clorogenic şi cafeic. Distanţa de migrare a fost de 8 cm (faza mobilă A) şi 16 cm (faza mobilă B). După uscare, cromatoplăcile au fost revelate cu o soluţie metanolică 10 g/L de difenilboriloxietilendiamină (DFBOA). Examinarea cromatoplăcilor s-a realizat în lumina UV (l = 365 nm), la o lampă Camag Reprostar 3 cu cameră Epson Photo PC850Z încorporată, înainte şi după revelare.

Determinarea spectrofotometrică a conţinutului de polifenoli totali şi taninuri s-a bazat pe reacţia cu reactivul Folin-Ciocâlteu, iar pentru flavone şi APFC, pe baza capacităţii acestora de a forma chelaţi în prezenţa clorurii de aluminiu, respectiv formarea oximelor în mediu acid şi în prezenţa reactivului Arnow (soluţie apoasă de azotit de sodiu) şi stabilizarea acestora în mediu alcalin. Pentru determinarea conţinutului de substanţe active s-au utilizat curbe etalon construite cu acid tanic (pentru polifenoli totali şi taninuri), hiperozidă (pentru flavone) şi acid clorogenic (pentru APFC). Toate determinările au fost efectuate la un spectrofotometru Jasco V-530 (Jasco, Japonia)(7).

Determinarea conţinutului de elemente minerale Conţinutul de elemente minerale a fost determinat prin spectrometrie de emisie atomică cu plasmă cuplată inductiv şi spectrometrie de absorbţie atomică în flacără(8).

Cercetări in vitro asupra liniei celulare EAhy926

Cercetările in vitro asupra celulelor endoteliale au vizat: influenţa extractului uscat asupra viabilităţii celulare în absenţa stresului oxidativ (verificarea unui potenţial efect citotoxic); determinarea concentraţiilor de apă oxigenată şi sulfat feros care reduc cu 50% viabilitatea celulară şi evaluarea efectului citoprotector în urma pre-tratamentului celulelor endoteliale cu concentraţii diferite de extract. Viabilitatea celulară a fost determinată pe baza testului MTT, care constă în reducerea bromurii de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium, de culoare galbenă, de către dehidrogenazele mitocondriale din celulele vii, la formazanul corespunzător de culoare violet.

Menţinerea celulelor în cultură. Celulele EAhy926 au fost cultivate în mediul DMEM cu 1‰ glucoză, 8,9 mg/L L-alanină, 15 mg/L asparagină, 13,3 mg/L acid aspartic, 14,7 mg/L acid glutamic, 11,5 mg/L prolină, 10 mg/L acid ascorbic, 0,4 mg/L biotină, 2,2 mg/L bicarbonat de sodiu, 110 mg/L acid piruvic, 1 mL selenit de sodiu, suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 U/mL penicilină şi 100 µg/mL streptomicină. Pentru determinările propriu-zise, celulele au fost cultivate în plăci de 96 de godeuri la o densitate de 8x103 celule/godeu şi menţinute în condiţii constante de temperatură şi umiditate (incubator, umiditate 95%, 5% CO2, 37°C).

Verificarea potenţialului citotoxic al extractelor. După atingerea confluenţei (72 de ore), celulele au fost starvate, prin înlăturarea serului fetal bovin din mediul de cultură. După 24 de ore de la starvare, mediul de cultură a fost înlocuit cu 200 µL mediu proaspăt, care conţine soluţii de concentraţie 0,005-0,3 mg/mL extract. Ulterior, celulele au fost incubate la 37°C timp de 24 de ore. Viabilitatea celulară (%) a fost evaluată faţă de un martor (control), reprezentat de celule nestimulate (menţinute doar în mediu DMEM), pentru care viabilitatea a fost considerată 100%.

Determinarea concentraţiei de apă oxigenată care reduce cu 50% viabilitatea celulară. Celulele starvate au fost supuse tratamentului cu concentraţii de 100 µM, 200 µM, 500 µM şi 1 mM apă oxigenată şi 100 µM sulfat feros. După 30 de minute, amestecul a fost îndepărtat şi celulele au fost incubate pentru 24 de ore în mediul DMEM, care conţine o cantitate minimă de ser (0,5%). Ulterior s-a determinat viabilitatea celulară, faţă de un martor (control) reprezentat de celule nestimulate.

Evaluarea efectului citoprotector al extractului s-a efectuat în urma pre-tratamentului celulelor cu 0,005-0,05 mg/mL extract timp de 24 de ore, urmat de tratarea acestora cu 500 µM apă oxigenată şi 100 µM sulfat feros timp de 30 de minute. Viabilitatea celulară a fost raportată la un martor, reprezentat de celule nestimulate şi comparată cu valoarea obţinută pentru celulele supuse stresului oxidativ, în absenţa pre-tratamentului.

Determinarea viabilităţii celulare prin tehnica MTT. Celulele supuse tratamentului cu extract/stresului oxidativ au fost tratate cu 200 µL soluţie 0,5 mg/mL MTT şi incubate la 37°C, timp de 2 ore, la întuneric. Formazanul obţinut a fost solubilizat în 100 µL HCl 0,1 M în isopropanol. Absorbanţa a fost măsurată la l = 570 nm (cititor de plăci Tecan, Austria).

Viabilitatea (%) a fost calculată conform formulei:
  

                                          ,  unde:

 

Am = absorbanţa soluţiei ce conţine celule nestimulate, cultivate doar în mediu de cultură, Ap = absorbanţa soluţiei ce conţine celule tratate cu extract/agenţi oxidanţi.

Analiza statistică. Rezultatele determinărilor spectrofotometrice reprezintă media ± deviaţia standard a cinci valori. Rezultatele in vitro, pe linia celulară, reprezintă media a patru determinări independente (efectuate în duplicat pentru fiecare concentraţie de extract/agent oxidant) şi au fost interpretate statistic pe baza testului ANOVA utilizând softul GraphPad Prism versiunea 5 pentru Windows. Rezultatele au fost considerate semnificative statistic dacă p < 0,05.

Rezultate şi discuţii

Prin cromatografie în strat subţire s-a evidenţiat prezenţa în extractul uscat a rutozidei (Rf = 0,21), quercitrozidei (Rf = 0,67), acidului clorogenic (doar după hidroliză, Rf = 0,18), acidului cafeic (Rf =0,92), quercetolului (Rf = 0,14) şi kaempferolului (Rf = 0,28), compuşi citaţi şi de literatura de specialitate consultată(5-6). De asemenea, se poate observa prezenţa unui spot cu fluorescenţă galbenă, de intensitate slabă, probabil corespunzător hiperozidei (Rf = 0,48). Analizând cromatogramele (figurile 1A, B), se pot observa şi alte spoturi cu fluorescenţă galbenă/galbenă-verzuie corespunzătoare unor compuşi cu comportament flavonic, rămaşi neidentificaţi din lipsa substanţelor de referinţă.

Determinările spectrofotometrice au evidenţiat că flavonele şi taninurile sunt compuşii majoritari ai extractului (figura 2). Acesta este stabil în condiţii de depozitare adecvate (flacoane brune, ferite de lumină şi umiditate), întrucât nu s-au înregistrat variaţii semnificative ale conţinutului de polifenoli pe durata a 12 luni.

Determinările spectrometrice au arătat că extractul uscat reprezintă şi o sursă de elemente minerale (calciu, potasiu, zinc, magneziu, mangan), cu rol important în patologia diabetului zaharat tip II şi a complicaţiilor acestuia (figura 3).

Dintre elementele minerale determinate, zincul influenţează stocarea insulinei la nivel pancreatic (prin intermediul transportorului ZNT8), stimulează activitatea fosfatidil-3-kinazei, inhibă activitatea glicogensintazei 3, menţine statusul antioxidant (cofactor al superoxid-dismutazei şi NADH-oxidazei), influenţează pozitiv metabolismul lipidic (scade trigliceridele) şi procesul inflamator (scade interleukina IL-1b)(9). Rubi idaei folium extractum este şi o sursă apreciabilă de magneziu (7.786 mg/kg). Se cunoaşte în prezent că hipomagnezemia, consecinţă a glucosuriei, acidozei metabolice sau microalbuminuriei, favorizează disfuncţia endotelială cu manifestări inflamatorii, proaterogene şi protrombotice. De asemenea, valorile reduse ale magneziului şi zincului sunt asociate cu valori ridicate ale hemoglobinei glicozilate(10).

Manganul şi cuprul intervin în statusul antioxidant, fiind cofactori ai mangan-superoxid dismutazei şi Cu/Zn superoxid-dismutazei(11). Extractul uscat are un conţinut apreciabil de potasiu (68.167 mg/kg) şi calciu (6.957 mg/kg), cu rol important în reglarea tensiunii arteriale(12), respectiv fosforilarea receptorului insulinic ISR1(13).

Cercetările in vitro asupra celulelor endoteliale EAhy926 se justifică datorită rolului acestora în apariţia complicaţiilor vasculare, caracteristice diabetului zaharat tip II. Printre factorii incriminaţi în apariţia disfuncţiei endoteliale se numără SRO, AGE şi creşterea numărului moleculelor de adeziune (SVCAM1, SICAM)(14). Rezultatele au evidenţiat că la concentraţii mici, cuprinse între 0,005-0,05 mg/mL, extractul nu modifică semnificativ statistic viabilitatea celulară (p > 0.05), în timp ce pentru concentraţia de 0,3 mg/mL, viabilitatea (66,79%) a scăzut semnificativ statistic (p < 0.0001) comparativ cu martorul (figura 4). Pentru concentraţia de 0,1 mg/mL, deşi nu au fost înregistrate variaţii semnificative statistic ale viabilităţii comparativ cu martorul, s-au observat modificări ale aspectului celulelor şi mediului de cultură (figura 4, figura 6C). Pe baza acestor observaţii, concentraţiile de 0,1 mg/mL şi 0,3 mg/mL au fost excluse din determinările experimentale ulterioare. Scăderea viabilităţii, respectiv efectul citotoxic manifestat la doze mari se pot datora unui efect pro-oxidant al constituenţilor fenolici şi proprietăţilor antiproliferative ale elagotaninurilor, demonstrate pe diferite linii celulare tumorale(15-16).

Concentraţiile de apă oxigenată şi sulfat feros care reduc cu 50% viabilitatea celulară sunt de 500 µM H2O2 şi 100 µM FeSO4 (figura 6B). Extractul protejează semnificativ statistic (p < 0,0001) celulele împotriva stresului oxidativ în domeniul de concentraţie 0,01-0,05 mg/mL (figura 5, figura 6D), cu creşterea viabilităţii celulare la valori de 66,87-83,77% comparativ cu 50% (pentru celulele supuse doar stresului oxidativ, în absenţa pre-tratamentului)

Efectul citoprotector se datorează probabil constituenţilor fenolici, cu rol antioxidant, manifestat prin capacitatea de scavenger al radicalilor liberi, chelatarea metalelor tranziţionale şi stimularea activităţii sistemului antioxidant endogen (superoxid-dismutază, catalază)(17). Dintre compuşii fenolici identificaţi, flavonele (quercetol, kaempferol, rutozidă, quercitrozidă) pot traversa membrana celulară printr-un mecanism pasiv(18). Acidul clorogenic difuzează prin membrană după o cinetică de tip Michaelis-Menten prin transportori specifici(19). Taninurile din frunzele de zmeur (lambertianin C,D, sanguiin H6) acţionează ca antioxidanţi prin acidul elagic, rezultat în urma hidrolizei(16). Considerăm că la efectul citoprotector participă şi elementele minerale implicate în reglarea statusului antioxidant endogen.

Concluzii

Rubi idaei folium extractum reprezintă o sursă considerabilă de compuşi naturali cu efect antioxidant. Efectul benefic în tratamentul disfuncţiei endoteliale caracteristice diabetului zaharat de tip II şi mediate de speciile reactive de oxigen nu a mai fost menţionat anterior în literatura de specialitate consultată. 

 

Bibliografie

  1. Hutcheson R., Rocic P. The metabolic syndrome, oxidative stress, environment and cardiovascular disease: the Great Exploration. Exp. Diabetes Res 2012; 2012: 271028.
  2. Roglic J., Unwin N. Mortality attributable to diabetes: estimates for the year 2010. Diabetes Research and Clinical Practice 2010; 87(1):15-19.
  3. Giacco F., Brownlee M., Schmidt A.M. et al. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research 2010; 107: 1058-1070.
  4. Dragan S., Wright D., Haavik S. et al. Polphenols - rich natural products for treatment of diabetes. Current Medicinal Chemistry 2015; 22(1):14-22.
  5. Patel A.V., Rojas-Vera J., Dacke C.G. Therapeutic constituents and actions of Rubus species. Current medicinal Chemistry 2004; 11(11):1501-1512.
  6. Pelc M., Przybyl J.L., Kasakowska O. et al. Genetic and chemical variability of wild Red Raspberry (Rubus idaeus L.) growing in Poland. ISHS Acta Horticulturae 860: IV International Symposium on Breeding Research on Medicinal and Aromatic Plants ISBMAP 2009.
  7. Costea T, Vlase L, Istudor V. et. al. Researches upon indigenous herbal products for therapeutic valorification in metabolic diseases. Note II. Polyphenols content, antioxidant activity and cytoprotective effect of Betulae folium dry extract. Farmacia 2014; 62(5):961-970.
  8. Elekes C.C, Dumitriu I., Busuioc G. et. al. The appreciation of mineral element accumulation level in some herbaceous plants species by ICP-AES method. Environ Sci Pollut Res 2010; 17:1230-1236.
  9. Prasad A.S. - Zinc: role in immunity, oxidative stress and chronic inflammation, Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 2009; 12(6):646-652.
  10. Vuktorinova A., Toserova E., Krizko M. et. al. Altered metabolism of copper, zinc, and magnesium is associated with increased levels of glycated hemoglobin in patients with diabetes mellitus. Metabolism Clinical and Experimental 2009; 58:1477-1482.
  11. El-Yazigi A., Hyannan N., Raines D.A. Urinary excretion of chromium, copper and manganese in diabetes mellitus and associated disorders. Research Clinical and Experimental 1991; 18(3):129-134.
  12.  Haddy F.J., Vanhoutte P.M., Feletou M. Role of potassium in regulating blood flow and blood pressure. AJP-Regu Physiol 2006; 290(3):546-552.
  13. Van Dam R., Hu F.B., Rosenberg L. et. al. Dietary calcium and magnesium major food sources and risk of type 2 diabetes in Black women. Diabetes Care 2006; 2(9):2238-2243.
  14. Popov D. Endothelial cell dysfunction in hyperglicaemia: phenotypic change, intracelluar signaling modification, ultrastructural alteration and potential clinical outcomes. International Journal of Diabetes Mellitus 2010; 2(3):189-195.
  15. Haliwell B. Are polyphenols antioxidants or pro-oxidants? What do we learn from cell culture and in vivo studies?, Archieves of Biochemistry and Biophysics 2008; 476(2):107-112.
  16. Ascacio-Valdés J.A., Bunerostro-Figueroa B.J.J., Carbo-Aguilera A. et. al. Ellagitannins: biosynthesis, biodegradation and biological properties. Journal of Medicinal Plant Research 2011; 5(19): 4696-4703.
  17. Pandey K.B., Bhooshan K., Rizoi I.S. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Celular Longevity 2009; 2(5):270-278.
  18. Tian X-Y., Yang X-W., Yang X. Studies of the intestinal permeability of 36 flavonoids using Caco-2-cell membrane monolayer model. International Journal of Pharmaceutics 2009; 367(1-2): 58-64.
  19.  Lafay S., Izquierdo A. Bioavailability of phenolic acids. Phytochem Rev. 2008; 7(2): 301-3011.

Articole din ediţiile anterioare

BIOCHIMIE | Ediţia 1 174 / 2017

Gerovital H3 – mecanisme biochimice implicate în acţiunea antioxidantă

Daniela Grădinaru, Claudia Borșa, Cristina Ionescu, Anca Ungurianu, Denisa Margină

Gerovitalul H3 și ingredientul său activ – procaina – exercită o acțiune antioxidantă prin următoarele mecanisme generale: inhibă direct generarea ...

03 aprilie 2017