Introducere
Producţia radicalilor liberi în organismul uman, în condiţii de stres, în cantitate superioară antioxidanţilor enzimatici (superoxid-dismutaza, catalaza, glutation-peroxidaza), duce la dereglarea capacităţii organismului de neutralizare a speciilor reactive. În consecinţă, apar leziuni celulare ce pot evolua către boli inflamatorii, boli cardiovasculare, cancer sau patologiile neurodegenerative(1). O soluţie pentru prevenirea acestor patologii o poate constitui aportul de antioxidanţi naturali, plecând de la inversa proporţionalitate între incidenţa îmbolnăvirilor şi dieta bogată în antioxidanţi(2,3,4). Un exemplu de aceşti derivaţi sunt derivaţii polifenolici, a căror asociere cu efectul antioxidant s-a intensificat după anii 2000(5). Aceştia îşi manifestă efectul antioxidant acţionând ca scavengeri, donori de hidrogen sau agenţi de chelatare asupra radicalilor liberi(6,7).
Urtica urens L. (urzicuţa) este o plantă anuală, membră a familiei Urticaceae, care se utilizează tradiţional în tratamentul diabetului zaharat şi al reumatismului, sub formă de decoct şi infuzie. Din punct de vedere chimic, în frunzele de urzicuţă sunt citaţi compuşi antioxidanţi: flavone (patuletină, rutozidă), acizi fenolici (acizii clorogenic, cafeic, galic şi elagic), cumarine (scopoletol), carotenoide (b-caroten)(8-10).
Capacitatea antioxidantă a extractelor diferă în funcţie de conţinutul fenolic al acestora, dar şi în funcţie de modul de extracţie a compuşilor. În acest sens, am încercat să stabilim parametrii optimi de extracţie (solvent şi procedeu) care duc la soluţii extractive cu un conţinut antioxidant maxim. De asemenea, am analizat contribuţia polifenolilor la inhibiţia radicalului sintetic.
Material şi metodă
Frunzele speciei Urtica urens L. au fost recoltate în aprilie 2013 din localitatea Răcari, judeţul Dâmboviţa. Câteva exemplare au fost presate şi păstrate în colecţia exsicata a Laboratorului de Farmacognozie-Fitochimie-Fitoterapie al Facultăţii de Farmacie, UMF „Carol Davila“, Bucureşti.
Calitatea produsului vegetal a fost evaluată prin examen chimic calitativ (reacţii chimice generale şi specifice, efectuate în scopul identificării principiilor active solubile în solvent apolar şi polar).
Obţinerea soluţiilor extractive
Soluţiile analizate s-au obţinut prin două procedee de extracţie (macerare şi refluxare), utilizând doi solvenţi (apă şi etanol 50%). Raportul produs vegetal-solvent folosit a fost de 0,5:50, iar timpul de contact a fost de 30 de minute pentru ambele procedee de extracţie.
Determinarea cantitativă a conţinutului de polifenoli totali (PT). S-a efectuat pe baza reacţiei cu reactivul Folin-Ciocâlteu(11). Sub acţiunea compuşilor fenolici, derivaţii de molibden Mo+6 (colorate în galben) se reduc la molibden Mo+4 şi Mo+5, coloraţi în albastru, a căror intensitate este direct proporţională cu concentraţia. Complexul albastru format se determină spectrofotometric la lungimea l=725 nm, fiind direct proporţional cu concentraţia fenolilor din mediu. Au fost utilizate volume de soluţie extractivă, cuprinse între 0,1-0,9 ml, diluate la 1 ml cu apă distilată şi tratate cu 1 ml reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat 1:1); aducerea la cotă s-a realizat cu carbonat de sodiu 200 g/l. După incubarea probelor la întuneric (40 de minte), s-a determinat absorbanţa (l=725 nm), faţă de un martor pregătit în condiţii similare probelor, cu excepţia soluţiei extractive. Calculul conţinutului de PT s-a efectuat utilizând o curbă etalon de acid tanic, obţinută în aceleaşi condiţii (R2 = 0,9998 , y = 0,0533 + 0,0605x).
Activitatea antioxidantă a fost determinată prin metoda DPPH, conform tehnicii originale descrise de Brand-Williams (1995) şi îmbunătăţită conform tehnicii propuse de Molyneau(12,13). Astfel, 2 ml desoluţie extractivă a fost tratată cu 2 ml de soluţie etanolică DPPH (0,06 M). Probele au fost incubate la întuneric timp de 30 de minute. Absorbanţa probelor a fost determinată la 517 nm (Abs = 0,70 ± 0,01) faţă de etanolul absolut (blank). Rezultatele au fost exprimate sub formă de factor IC50 (µg/ml) şi de procente de inhibiţie(13).
Toate determinările spectrofotometrice au fost efectuate utilizând spectrofotometrul Jasco V-530.
Corelaţia între cantitatea de PT şi inhibiţia radicalului DPPH a fost efectuată pe baza ecuaţiilor liniare între conţinutul de PT al extractelor analizate şi valorile procentelor de inhibiţie obţinute.
Rezultate şi discuţii
Examenul chimic calitativ a indicat prezenţa sterolilor, carotenoidelor, poliholozidelor, cumarinelor, acizilor fenolici, flavonelor, proantocianilor, taninurilor şi a saponozidelor. Rezultatele examenului chimic calitativ coincid cu datele din literatura de specialitate(8-10).
Cel mai mare conţinut de polifenoli totali s-a obţinut prin extracţie cu etanol 50%, utilizând ca procedeu de extracţie refluxarea (figura 1). Conţinutul de polifenoli totali este favorizat de temperatura ridicată, probabil datorită creşterii solubilităţii compuşilor şi a coeficientului de difuziune în soluţie al acestora(14).
Valoarea factorului IC50 este corelată invers proporţional cu activitatea antioxidantă a extractelor. Astfel, se constată că cea mai bună activitate antioxidantă s-a observat în cazul extractelor obţinute în etanol 50%, comparativ cu cele obţinute în apă (figura 2). Acest rezultat indică o bună solubilizare a derivaţilor fenolcarboxilici, principalii compuşi cu caracter antioxidant(10). Din punctul de vedere al procedeului de extracţie, s-a observat că macerarea a condus la obţinerea de extracte cu o activitate anti‑radicali liberi superioară celor obţinute prin refluxare. O posibilă explicaţie constă în scăderea activităţii antioxidante a polifenolilor ca urmare a extracţiei acestora la temperatură ridicată(15). Un alt considerent este şi faptul că prin macerare substanţele termolabile (de exemplu, acidul ascorbic) nu se degradează, participând astfel la reducerea radicalului liber DPPH.
Corelaţia între conţinutul polifenolic şi inhibiţia radicalului DPPH este evaluată pe baza valorii coeficientului Pearson. Din analiza rezultatelor prezentate în figura 3 se observă că derivaţii fenolici au un aport important la efectul antioxidant al extractelor obţinute prin refluxare (R2 = 0,4817). Pentru extractele obţinute prin macerare, factorul de corelaţie are valori mai mici (R2 = 0,262) probabil datorită existenţei altor compuşi cu caracter antioxidant (acid ascorbic, carotenoide, heterozide sterolice).
Concluzii
Utilizarea etanolului 50% şi a macerării permite obţinerea de extracte cu un important potenţial anti‑radicali liberi. Cel mai mare conţinut de PT se obţine prin refluxare. Polifenolii totali contribuie la efectul antioxidant al extractelor, mai ales în cazul macerării.
Pe baza rezultatelor obţinute, putem considera că specia Urtica urens L. poate fi folosită ca sursă de compuşi cu acţiune antioxidantă.