Progresul în domeniul tehnicilor de reproducere asistată

La nivel mondial, unul din şase cupluri se confruntă cu probleme de infertilitate cel puţin o dată pe durata perioadei reproductive a cuplului. Prevalenţa actuală a infertilităţii este estimată la aproximativ 9% la nivel mondial pentru femeile cu vârste cuprinse între 20 şi 44 de ani⁽¹⁾. O dată cu dezvoltarea societăţii moderne, creşterea vârstei partenerului de sex feminin este o cauză din ce în ce mai frecventă care, împreună cu factori ce ţin de stilul de viaţă (fumatul, stresul, greutatea corporală), se adaugă cauzelor clasice de infertilitate.

Tehnicile de reproducere asistată reprezintă procedee medicale concepute pentru a rezolva problema infertilităţii. Rezultatul direct urmărit este obţinerea unei sarcini prin manipularea în laborator a gameţilor, ceea ce implică punerea lor în contact în vederea fertilizării. Mai mult, în urma tratamentelor pentru infertilitate se aspiră şi la naşterea unui copil sănătos. Din 1978, anul în care s-a născut primul copil după fertilizare in vitro în Anglia, peste 5 milioane de copii s-au născut în toată lumea în urma aplicării diferitelor procedee de fertilizare in vitro. Datele statistice arată că în prezent, pe plan mondial, se desfăşoară anual aproximativ un milion şi jumătate de cicluri asistate prin diferite tehnici de reproducere, ce se finalizează cu aproximativ 350.000 de nou-născuţi⁽¹⁾.

În prezent, tehnicile de reproducere asistată îmbracă două forme: inseminarea artificială şi fertilizarea in vitro.

Inseminarea artificială presupune prelucrarea în laborator a spermei şi introducerea acesteia intrauterin în perioada fertilă. Succesul inseminării artificiale într-o formă incipientă, fără prelucrarea spermei, a fost raportat încă din secolul al XVIII-lea. Secole mai târziu, prepararea spermei pentru inseminare artificială urmăreşte selectarea spermatozoizilor mobili şi activi prin separarea lor de spermatozoizii imobili, de lichidul seminal şi, eventual, de agenţi infecţioşi, leucocite sau proteine antigenice. Se adaugă o cantitate mică de mediu nutritiv pentru activarea lor. Metodele de preparare au progresat de la spălarea simplă la metoda „swim-up”/„sperm-rise” şi la metoda gradientelor de densitate care oferă cea mai bună selecţie, în special la pacienţii cu spermă de calitate slabă. Aceste metode se pot folosi separat sau în asociere. Se poate utiliza spermă de la partener, proaspătă, de obicei recoltată în ziua inseminării, sau de la donator, spermă congelată din Banca de Spermă. Donatorii anonimi sunt riguros testaţi în scopul evitării transmiterii unor boli.

Investigaţiile cuplului trebuie să cuprindă evaluarea globală, preconcepţională şi evaluarea infertilităţii, având în vedere indicaţiile şi condiţiile necesare pentru inseminarea artificială (permeabilitatea tractului genital feminin, prezenţa ovulaţiei, un număr adecvat de spermatozoizi mobili, normali morfologic).

Diverse studii clinice au demonstrat că rata de succes a inseminării artificiale creşte când procedura este asociată cu stimularea ovariană controlată comparativ cu inseminarea în cadrul unui ciclu natural^(3,4). Pentru stimularea ovariană se foloseşte cel mai adesea clomifenul citrat, dar se pot utiliza şi menotropina (hMG), FSH urinar pur sau FSH recombinat pentru o stimulare mai puternică. Scopul este de a obţine 3-4 foliculi maturi pentru a creşte şansele de succes, dar, asociat acestei tendinţe actuale de stimulare ovariană, s-au constatat creşterea ratei de sarcini multiple şi asocierea complicaţiilor specifice stimulării ovariene, mai des întâlnite în cazul fertilizării in vitro.

Rezultatele depind de stabilirea momentului optim al inseminării prin estimarea cât mai precisă a ovulaţiei. Monitorizarea ovulaţiei se poate face ecografic, cu avantajul de a evalua numărul de foliculi ovarieni, sau hormonal. Declanşarea ovulaţiei se face prin administrarea de gonadotropină corionică (hCG). Inseminarea se face de obicei în ziua estimată a ovulaţiei sau în ziua precedentă. Cu toate că se pot face două inseminări la interval de 24 de ore, nu s-au constatat creşteri semnificative ale ratei de succes în această practică atunci când momentul inseminării unice este ales corect.

Rata de succes a inseminării artificiale este apreciată la 5-20% la un ciclu⁽⁴⁾. Asocierea superovulaţiei prin stimulare ovariană controlată poate aduce şansele spre limita superioară, la 15-20%, dar favorizează apariţia unei sarcini multiple în 10-25%⁽⁵⁾. Avortul spontan, riscul de sarcină ectopică şi prognosticul fetal sunt similare sarcinilor spontane.

Fertilizarea in vitro presupune prelucrarea în laborator atât a spermei, cât şi a ovocitelor, fertilizarea în laborator şi cultivarea in vitro a embrionilor, iar ulterior transferul acestora în organismul matern. Termenul de fertilizare in vitro are o accepţiune globală, reunind toate procedeele care parcurg aceste etape. În ultimul deceniu, s-au dezvoltat diferite procedee sau variante tehnice, de la metode de fertilizare, tehnici de micromanipulare, până la procedee de conservare, programe de donare sau mamă surogat.

Unele procedee elaborate pe parcursul evoluţiei tehnicilor de reproducere asistată nu se mai utilizează de rutină, dar îşi pot demonstra beneficiile în anumite situaţii specifice. Aceste variante de concepţie asistată sunt reprezentate de GIFT (Gamete Intrafallopian Transfer), ZIFT (Zygote Intrafallopian Transfer), PROST (Pronuclear Stage Transfer), TET (Tubal Embryo Transfer).

În cadrul fertilizarii in vitro se recurge la stimularea ovariană controlată sau hiperstimularea ovariană controlată, pentru a obţine o superovulaţie în condiţiile controlării momentului ovulator. Scopul stimulării ovariene este de a permite recoltarea unui număr suficient de ovocite astfel încât, în urma proceselor de fertilizare şi diviziune celulară, să se obţină cel puţin 2-3 embrioni de bună calitate pentru embriotransfer. Pentru a creşte şansele de succes au fost dezvoltate diferite regimuri de stimulare ovariană, folosind clomifen citrat, menotropine, FSH purificat sau recombinat genetic, GnRH pulsatil sau combinaţii ale acestora. Un progres semnificativ a fost realizat prin introducerea în protocoalele de stimulare a analogilor de GnRH care desensibilizează hipofiza şi previn descărcarea prematură de LH. Astfel, prin protocoalele lungi, scurte sau ultrascurte cu analogi de GnRH se realizează un mai bun control al stimulării, prevenirea ovulaţiei premature şi o rată mai mare de sarcini^(5,7). Ulterior, au fost introduşi şi antagoniştii de GnRH, cu aceleaşi efecte. Pentru maturarea finală a ovocitelor şi declanşarea ovulaţiei se utilizează hCG sau, mai recent, LH recombinat.

Variaţiile individuale ale răspunsului la stimularea ovariană cu FSH este o problemă larg răspândită, cu implicaţii clinice şi economice. Categoria „poor responders” reuneşte pacientele care necesită o doză crescută de FSH pentru a obţine un număr suficient de ovocite, în timp ce termenul „high responders” se referă la pacientele care produc un număr mare de ovocite mature, cu riscul de a dezvolta sindromul de hiperstimulare ovariană la administrarea unei doze reduse de FSH⁽⁷⁾. Studii clinice indică faptul că polimorfismul receptorilor gonadotropici influenţează rezultatul obţinut prin hiperstimulare ovariană⁽¹⁵⁾. De aceea, identificarea polimorfismului receptorilor FSH înainte de iniţierea tratamentului pentru stimulare ovariană ar putea permite stabilirea dozei optime de start pentru FHR recombinat încă de la primul ciclu de stimulare. Astfel, s-ar preveni anularea ciclului de stimulare, ca urmare a unui răspuns prea slab sau prea puternic, iar riscul de apariţie al sindromului de hiperstimulare ovariană ar putea fi redus.

Sindromul de hiperstimulare ovariană (SHSO) este cea mai redutabilă complicaţie a stimulării ovariene practicate în cadrul fertilizării in vitro. Mecanismul declanşator este reprezentat de creşterea bruscă a permeabilităţii vasculare cu apariţia acumulărilor lichidiene în cel de-al treilea compartiment, în special în cavitatea peritoneală. Astfel se produce o scădere marcată a volumului intravascular şi hemoconcentraţie, cu posibilitatea de a progresa către insuficienţă renală, şoc hipovolemic, episoade tromboembolice, sindrom de detresă respiratorie acută şi chiar deces. Date statistice din SUA raportează o incidenţă de 25% a formei uşoare, respectiv 0,1-0,2% din toate ciclurile FIV pentru forma severă a SHSO⁽⁷⁾. Societatea Europeană de Reproducere Umană şi Embriologie raportează o incidenţă medie de 0,5% din toate ciclurile FIV desfăşurate în ţările europene⁽¹⁾.

La începuturile fertilizării in vitro, recoltarea ovocitelor s-a făcut pe cale laparoscopică sau prin puncţie transabdominală sau transvezicală. În prezent, se utilizează aproape exclusiv puncţia transvaginală ghidată ecografic. După aspiraţia foliculară, se identifică complexele ovocit-cumulus şi se separă de lichidul folicular. Ovocitele rezultate după superovulaţie sunt în diferite stadii de maturare, dar, pentru a fi fecundat, ovocitul trebuie să fie matur, în stadiul de metafază II (după expulzia primului globul polar). Maturarea ovocitelor in vitro este o procedură experimentală care, în prezent, se poate efectua în centre specializate. Această tehnică presupune recoltarea ovocitelor, în cadrul ciclurilor nestimulate cu LH sau hCG, şi, ulterior, maturarea lor în laborator din stadiul de veziculă germinală, prin meioza I, în stadiul de metafază II⁽¹²⁾.

În ceea ce priveşte patologia masculină, în cazul pacienţilor azoospermici, s-au dezvoltat o serie de tehnici de recoltare a spermatozoizilor din epididim sau testicul: aspiraţie epididimară microchirurgicală (MESA) sau percutanată (PESA), biopsie testiculară chirurgicală (TESE) sau biopsie testiculară percutană prin aspiraţie (TESA). În azoospermia obstructivă, şansele de recoltare a unui număr suficient de spermatozoizi sunt mari şi se poate folosi o tehnică mai puţin invazivă, precum aspiraţia percutană sau biopsia percutană cu ac. Rezultatele FIV nu vor fi influenţate de durata obstrucţiei sau de motilitatea spermatozoizilor atât timp cât în urma recoltării se obţin spermatozoizi viabili⁽¹⁰⁾. În azoospermii de alte cauze poate fi nevoie de biopsie testiculară deschisă, cu recoltare din mai multe locuri.

Prepararea spermei, proaspătă sau congelată, se face prin aceleaşi metode de bază folosite pentru inseminarea artificială (spălare, swim-up, gradienţi de densitate), tehnici swim-down sau swim-over, eventual combinaţii ale acestora.

Inseminarea ovocitelor cu spermă în vederea fertilizării se face pe scară largă, în principal prin două tehnici: fertilizarea in vitro standard (FIV standard) şi injectarea spermatozoidului în citoplasma ovocitului (ICSI).

Fertilizarea in vitro standard este o tehnică folosită încă din primii ani, astfel acumulându-se experienţa considerabilă a trei decenii de practică. În prezent este aplicată în circa o treime dintre toate ciclurile FIV⁽¹⁾. Tehnica presupune punerea în contact a unui ovocit cu un anumit număr de spermatozoizi (50.000-100.000 spermatozoizi mobili), urmând ca fertilizarea să se producă spontan. Aceasta este confirmată, după un interval de 16-18 ore, prin eliberarea celui de-al doilea globul polar şi formarea a doi pronuclei.

Un pas important l-a reprezentat dezvoltarea tehnicilor de micromanipulare a gameţilor pentru a facilita procesul de fecundare. Aceste tehnici au fost introduse după 1990, ca urmare a ratelor foarte scăzute de fertilizare asociate patologiei masculine severe, precum şi eşecului total de fertilizare întâlnit în unele cazuri de FIV standard. „Partial zona dissection” (PZD)  a fost prima tehnică introdusă şi constă în crearea unei deschideri în zona pellucidă, facilitând astfel accesul spermatozoidului în spaţiul perivitelin. Ulterior a fost introdusă tehnica denumită „subzonal sperm injection” (SUZI), care constă în injectarea spermatozoizilor sub zona pellucidă a ovocitului. Ratele de succes evaluate prin numărul de sarcini obţinute şi de nou-născuţi au fost foarte scăzute atât pentru PZD, cât şi pentru SUZI, descurajând folosirea lor pe scară largă⁽¹¹⁾.

Introducerea tehnicii ICSI de un grup de cercetători belgieni a revoluţionat managementul infertilităţii de cauză masculină, făcând posibilă fertilizarea chiar şi atunci când spermatozoizii disponibili erau foarte puţini sau aveau defecte ale enzimelor implicate în fecundare. În anul 1992 au fost raportate primele sarcini obţinute în urma injectării spermatozoidului în citoplasma ovocitului (ICSI). În prezent, ICSI se practică pe scară largă în multe centre pentru a creşte rata globală de fertilizare a ovocitelor, şi anume în circa două treimi dintre toate ciclurile FIV⁽¹²⁾.

Cultivarea embrionilor se face în condiţii speciale, utilizând medii de cultură cât mai apropiate de mediul natural matern. În prezent se preferă mediile secvenţiale, diferite în funcţie de stadiul embrionar. În general, embrionii se cultivă pentru 48-72 de ore, dar se pot cultiva şi până la stadiul de blastocist (5-6 zile), în scopul unei mai bune selecţii a embrionilor, cu o rată de implantare mai bună, şi pentru a realiza embrio-transferul cât mai aproape de ziua implantării. Cu toate acestea, ratele de fertilizare şi de nou-născuţi pentru aceste două variante temporale de embrio-transfer nu diferă semnificativ⁽¹³⁾.

Având în vedere rata mică de implantare a embrionilor, transferul mai multor embrioni în acelaşi timp a crescut considerabil şansele de a obţine sarcina şi, ulterior, şansele unei naşteri cu unul sau mai mulţi feţi vii. O consecinţă firească a acestei practici a fost creşterea incidenţei sarcinilor multiple. Patologia obstetricală şi perinatală aferentă acestor sarcini multiple justifică tendinţa actuală de reducere a numărului de embrioni pe embrio-transfer. Dacă totuşi apar sarcini cu mai mult de doi embrioni se poate apela la reducţia embrionară prin injectarea intracardiac sau intratoracic, sub ghidaj ecografic, a unei substanţe de tipul clorurii de potasiu. Această opţiune, deşi justificată medical, poate aduce cuplul în faţa unei dileme, necesitând consiliere atât asupra implicaţiilor etice, cât şi asupra principalelor riscuri asociate, şi anume pierderea sarcinii şi naşterea prematură⁽¹⁴⁾.

Crioconservarea embrionilor, spermei, ţesutului testicular şi, mai recent, a ovocitelor sau a ţesutului ovarian a permis realizarea reproducerii în anumite condiţii speciale, aducând reale beneficii pentru tratamentul infertilităţii. Astfel au fost mărite şansele reproductive în cazul pacienţilor tineri supuşi unor tratamente chirurgicale sau chimioterapice sau prin utilizări multiple ale unor gameţi sau embrioni obţinuţi în cadrul unei singure intervenţii. Conservarea spermei cu bune rezultate şi posibilitatea ulterioară de a o folosi pentru procedee simple de inseminare artificială au condus la dezvoltarea pe scară largă a băncilor de spermă. Acestea le permit pacienţilor să îşi stocheze propria spermă, dar au şi rolul de a furniza spermă de la donatori. Indiferent de metoda utilizată, crioconservarea este grevată de pierderi semnificative de embrioni, iar rata de sarcini după embriotransfer cu embrioni congelaţi este mai mică decât în cazul embrionilor proaspeţi⁽⁵⁾.

Programele de donare de gameţi sau embrioni s-au dezvoltat rapid, odată cu răspândirea fertilizării in vitro. Donarea de ovule poate reprezenta o soluţie a infertilităţii în cazul unei patologii ovariene severe, al unor afecţiuni genetice transmisibile sau în cazul menopauzei. Donarea de embrioni implică de obicei cuplurile care, după ce au obţinut numărul dorit de copii, aleg să doneze embrionii care au rămas conservaţi. Fertilizarea in vitro a permis şi posibilitatea utilizării mamei surogat pentru cuplurile în care infertilitatea este dată de absenţa uterului sau malformaţii congenitale ale uterului ce nu permit menţinerea sarcinii. Datorită aspectelor psihologice şi etice implicate în aceste cazuri, dar şi a experienţei anterioare, în majoritatea ţărilor europene sunt interzise programele FIV cu mamă surogat⁽⁵⁾.

În ultimul deceniu s-au dezvoltat şi metodele de diagnostic genetic preimplantare prin analiza genetică a embrionilor. Astfel, se pot alege pentru embrio-transfer doar embrionii sănătoşi. Din 1990, când a fost înregistrat primul succes, în cazul unui cuplu cu risc de a avea copii cu fibroză chistică, tehnica a evoluat şi permite un diagnostic genetic rapid şi precis. Pentru diagnostic se foloseşte material genetic obţinut prin biopsie de globuli polari sau blastomere⁽²⁰⁾. Prin această metodă se pot testa anomalii autozomal recesive sau dominante, anomalii legate de sex, aneuploidii sau translocaţii şi, mai recent, se pot testa embrionii pentru compatibilitate în sistem HLA. În acest context, dacă selecţia sexului în anumite boli genetice este justificată medical, selecţia sexului pentru raţiuni nemedicale ridică motive de îngrijorare.

Deşi în fază experimentală, unele tehnici noi de micromanipulare au dat deja rezultate. Printre acestea se numără transferul de citoplasmă din ovocitele donate către ovocitele primitoare pentru a îmbunătăţi dezvoltarea embrionară; în 1997 a fost raportat primul nou-născut în urma aplicării acestui procedeu⁽¹⁶⁾. În această categorie se încadrează şi reconstituirea zigoţilor cu număr anormal de pronuclei şi multiplicarea embrionilor disponibili pentru embrio-transfer prin secţionare sau transfer nuclear embrionar în ovocite enucleate.

Ultimele patru decenii au adus schimbări radicale în tratamentul infertilităţii. Mai mult, dacă progresul rapid înregistrat în ultimul deceniu în domeniul reproducerii asistate va fi susţinut, perspectivele dezvoltării în această direcţie ar putea revoluţiona practica medicală curentă. Dezvoltarea de noi tehnici de reproducere asistată ar putea permite cazurilor de infertilitate, care astăzi par imposibil de soluţionat, să îşi îndeplinească visul de a avea un nou membru al familiei mai repede decât credeam.