PREZENTARE DE CAZ

Microcalorimetria – o metodă cu potenţial în diagnosticul infecţiilor ortopedice

 Microcalorimetry – a promising method for the diagnosis of orthopedic infections

First published: 26 aprilie 2017

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Inf.49.1.2017.689

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous environmental microorganism, which can cause various infections, including infections of the skin or soft tissues, of joints or bones. Infections may have a fulminant course; therefore the rapid diagnosis is very important. Microcalorimetry technique allows the identification of P. aeruginosa in a very short time compared to classical methods. We present the case of a 94-year-old woman, who addressed our clinic for a wound located on her left hip, with a discharge of a purulent fluid on its surface. A month earlier at that level she had had a fracture for which she had undergone a surgical intervention. P. aeruginosa was isolated by classical microbiological methods. Using the microcalorimetry technique, the microorganism was identified in 11 hours.
 

Keywords
Pseudomonas aeruginosa, microcalorimetry, diagnosis

Rezumat

Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, ubicuitar, care poate produce infecții variate, incluzând infecții la nivelul pielii sau al țesuturilor moi, la nivelul articulațiilor sau al oaselor. Infecțiile pot avea uneori o evoluție gravă, de aceea diagnosticul rapid este foarte important. Tehnica microcalorimetriei permite identificarea P. aeruginosa într-un timp foarte scurt în comparație cu metodele clasice. Prezentăm cazul unei paciente în vârstă de 94 de ani care s-a adresat clinicii noastre pentru o plagă cu lichid purulent la nivelul șoldului stâng. În urmă cu o lună, la acest nivel a avut o fractură pentru care s-a intervenit chirurgical. De la nivelul plăgii s-a izolat P. aeruginosa prin diagnostic microbiologic clasic. Utilizând metoda microcalorimetriei, microorganismul a fost identificat în 11 ore. 
 

Introducere

Pseudomonas aeruginosa este un microorganism oportunist, ubicuitar, Gram-negativ pe frotiul colorat, prezintă rezistență la numeroase antibiotice și poate să se dezvolte în medii sărace nutritiv. Poate produce infecții la nivelul pielii sau al țesuturilor moi, în cazul pacienților diabetici, cu fibroză chistică, cu afecțiuni ale articulațiilor sau ale oaselor. În plus, în secțiile de terapie intensivă poate determina pneumonii asociate ventilației mecanice, infecții ale tractului urinar sau bacteriemii cu diseminare potențială la orice nivel(1,2). Bineînțeles că și pacienții cu imunodeficiențe de diferite cauze, cum ar fi infecția HIV, cei sub tratament citostatic sau cei imunocompromiși în urma unui transplant de organ pot fi afectați(3).
Pseudomonas aeruginosa secretă proteine, lectine și exoenzime care determină distrugeri tisulare importante, prin ruperea structurilor normale citoscheletale, iar formarea de biofilm conferă o rezistență importantă împotriva tratamentelor antibiotice. Identificarea și tratarea corectă a infecțiilor reprezintă puncte-cheie care pot salva viața pacientului(4,5,6).
Domeniul medical este într-o continuă dezvoltare, iar medicina modernă ne-a ajutat să putem folosi instrumente medicale din ce în ce mai complexe în multe specialități. Combinația dintre numărul crescând de dispozitive implantabile și îmbătrânirea populației va genera, foarte probabil, o creștere a complicațiilor legate de dispozitivele medicale. În momentul actual, aproape 50% din toate infecțiile nosocomiale sunt asociate cu instrumente medicale în diferite ipostaze(7). Aceste infecții apar fie prin bacteriemie, fie printr-o afecțiune la nivelul pielii sau al țesuturilor moi, diseminând ulterior la nivelul unor dispozitive intracardiace sau al unor endoproteze, în cazul ortopediei. Managementul acestor patologii este complex, rezultatul putând să fie dezastruos dacă tratamentul nu este realizat foarte rapid după debutul infecției și urmând protocoale prestabilite. Tratamentul este foarte costisitor pentru sistemele de sănătate, pentru că, fiind vorba despre dispozitive medicale, în multe cazuri acestea trebuie extrase, urmat un tratament corect până la vindecare și apoi reimplantate. În cazul materialelor străine, riscul ca bacteria să formeze biofilm pe suprafața acestora este foarte mare. Microorganismul sintetizează o matrice extracelulară polimerizată care generează o capacitate crescută de adeziune și rezistență importantă față de tratamentul medicamentos, impunând extragerea materialului implantat(8,9).
Calorimetria modernă a început să se dezvolte relativ recent; primul microcalorimetru diferențial cu scanare apărând în jurul anului 1970. Cu acest aparat este posibilă analizarea termică a căldurii degajate în diverse condiții de unele microorganisme. Pentru a realiza această analiză termică trebuie să existe o alterare a temperaturii ambientale care să genereze o modificare în metabolismul bazal al agentului microbian studiat. Pe lângă modificări de temperatură, mediul folosit, precum și adăugarea sau nu a unui antibiotic pot să ne ajute în diferite studii(10,11). 
Microcalorimetria izotermă măsoară temperatura degajată de multiplicarea microorganismelor și, cu ajutorul unui software adaptat, descrie în timp real curba de creștere bacteriană în funcție de semnalul electric primit de la aparat. Această metodă a fost folosită deja pentru a măsura producerea de căldură a bacteriilor, celulelor de mamifere și a viermilor. Timpul de detecție depinde în primul rând de sensibilitatea instrumentului, dar și de numărul de celule viabile introduse inițial și de cantitatea de căldură generată de acestea(12,13,14).
image001
image001
image002
image002


Prezentarea cazului

Avem în vedere cazul unei paciente în vârstă de 94 de ani, care s-a internat în Spitalul Universitar de Urgență București (SUUB), în Secția de Ortopedie și Traumatologie, ca urmare a exteriorizării unui lichid purulent de la nivelul șoldului stâng. Pacienta a suferit în urmă cu aproximativ o lună o intervenție la acest nivel pentru o fractură trohantero-diafizară, survenită în urma unui traumatism prin precipitare de la același nivel. După traumatism, pacienta a fost operată în alt serviciu, unde s-a practicat reducere și osteosinteză cu un cui Gamma. 
La momentul prezentării în SUUB, pacienta era conștientă, cooperantă, acuzând durere la nivelul șoldului. La inspecție, prezenta două traiecte fistuloase de la nivelul cărora se exterioriza lichid purulent de culoare galben‑cenușie (figura 1). Pacienta era cunoscută cu hipertensiune arterială, diabet zaharat tip II și obezitate morbidă. La internare, pacienta prezenta următoarele probe inflamatoare: fibrinogen 665,49 mg/dL (max. 498), VSH 118 mm/h (max. 10) și PCR 13,13 mg/dL (max. 0,5). S-a recoltat lichid de la nivelul plăgii, izolându-se Pseudomonas aeruginosa cu sensibilitate la majoritatea antibioticelor testate, dar cu rezistență la ceftazidim și gentamicină. 
După stabilirea diagnosticului s-a început tratamentul antibiotic cu piperacilină + tazobactam și s-a intervenit chirurgical pentru excizia zonelor de necroză. După pregătirea preoperatorie s-a practicat debridarea excizională până în țesut sănătos (figura 2), urmată de lavajul abundent cu apă oxigenată, soluție antiseptică și apoi soluție salină fiziologică. S-a continuat tratamentul antibiotic instituit conform testării sensibilității la antibiotice, iar pacienta a fost externată după ce probele inflamatoare și examenul clinic au revenit la valori normale.
image003
image003
image004
image004


Experimentele microcalorimetrice

Proba recoltată de la pacientă a fost însămânțată direct atât pe mediu solid pentru a obține colonii izolate, cât și în mediu lichid Müller-Hinton (MH) și lăsată pentru a permite multiplicarea microorganismelor în termostat la 37 °C, 24 de ore. După obținerea culturii izolate s-a recoltat o probă și s-a reînsămânțat în mediu lichid MH în aceleași condiții ca mai sus. 
Pornind de la culturile obținute în cele două medii de cultură însămânțate, s-au realizat două experimente microcalorimetrice, pentru a vedea dacă prin această metodă se poate identifica microorganismul și dacă se poate pune în evidență sensibilitatea sa. Ambele experimente au fost realizate la o temperatură a microcalorimetrului de 37 °C, după cum urmează: în primul rând, s-au recoltat din mediul lichid în care s-a dezvoltat bacteria 1000 µl care au fost transferați într-un tub Eppendorf și centrifugați la 3000 rpm, 2 minute, până când s-a realizat separarea dintre mediul lichid și mediul solid, iar apoi s-a extras lichidul și s-au adăugat 300 µl de MH. În același timp, s-a pregătit un tub nefelometric cu mediu lichid MH și s-a măsurat indicele Mac Farland (IMF), acesta fiind 0,23. În următorul pas s-a pipetat din tubul Eppendorf în tubul nefelometric până când IMF-ul celui din urmă a crescut cu 0,1. Am realizat aceasta pentru standardizare. Ulterior s-a realizat diluția 10-2 a soluției, pentru că altfel numărul de bacterii ar fi devenit prea mare și s-ar fi dezvoltat prea repede, generând artefacte pe termogramă. După ce s-a realizat diluția, s-au recoltat 600 µl care s-au introdus într-o celulă microcalorimetrică; aceasta reprezintă proba de studiat. În același timp, s-a pregătit o celulă microcalorimetrică cu 600 µl de mediu MH neînsămânțat (martor). Ambele celule au fost introduse în microcalorimetru la 37 °C și lăsate 24 de ore. În figurile 3 și 4 se pot examina ambele experimente, bacteriile dezvoltându-se asemănător, într-un interval de 11 ore.

Discuții

Infecțiile, atât în ortopedie, cât și în celelalte domenii medicale, reprezintă unul dintre cei mai importanți factori negativi atunci când avem în vedere prognosticul pe termen scurt sau lung al unei intervenții. Dacă discutăm despre prognosticul pe termen scurt, este de așteptat ca apariția unei infecții să conducă la o refacere deficitară sau la absența refacerii țesuturilor. În cazul evoluției pe termen lung, infecția se poate extinde în profunzime și în acest caz va afecta într-o mare masură funcția membrului operat. Existența unei soluții de continuitate la nivel tegumentar (determinată intraoperator sau posttraumatic) va crea un mediu propice grefării și apoi multiplicării unor bacterii. În cazul infecțiilor de plagă, P. aeruginosa este unul dintre cel mai frecvent izolați agenți microbieni(15,16).
Patologia infecțioasă ortopedică apare cel mai frecvent în cazul fracturilor în care s-a practicat reducere și osteosinteză cu diferite materiale de fixare sau în cazul gonartrozelor și coxartrozelor tratate prin artroplastie totală cu endoproteze. În majoritatea cazurilor, fiind vorba despre materiale străine, bacteriile generând biofilm se ancorează cu multă ușurință de acestea. Dezvoltarea biofilmului conduce la dificultăți majore în tratament. În acest tip de infecții, cel mai frecvent întâlnit (în aproximativ 30-40% dintre cazuri) este genul Staphylococcus, urmat de genul Streptococcus (10%), Enterococcus (7%), bacterii Gram-negative (5%) și de germeni anaerobi (3%)(17,18). De remarcat prevalența crescută, în ultima perioadă, a infecțiilor cu bacterii Gram-negative care secretă betalactamaze cu spectru larg(19). Mulți autori opinează că aceste probleme se vor extinde ca urmare a numărului crescând al pacienților cu vârste înaintate, care suferă de diabet, se află în tratament oncologic sau au suferit un transplant de organ. Pe de altă parte, este de luat în seamă și intensificarea fenomenului de rezistență la antibiotice. Ca atare, în literatura de specialitate internațională (ex.: în cazul rețelei de sănătate publică a SUA) infecțiile cu P. aeruginosa ocupă al patrulea loc în topul celor mai frecvente infecții în cazul implanturilor medicale(20,21). Luând în considerare aceste date, rezultate în urma unor studii extinse, este necesar să ne pregătim în vederea unui diagnostic pozitiv corect și realizat cât mai curând posibil.

Concluzii

Pseudomonas aeruginosa este un microorganism versatil, oportunist, dar care poate fi implicat patogenic în anumite situații. Din cauza numeroaselor sale elemente de virulență, odată implicat în infecție, devine dificil de tratat. Tratamentul corect și rapid depinde de o identificare cât mai promptă. Așa cum am arătat, utilizând tehnica microcalorimetriei, identificarea P. aeruginosa s-ar putea realiza în mai puțin de 12 ore. Testele descrise mai sus trebuie repetate pentru a demonstra corelația și reproductibilitatea acestora.   n

Conflict of interests: The authors declare no conflict of interests.

Bibliografie

  1. Pollack M. Pseudomonas aeruginosa. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed. New York, NY: Churchill Livingstone; 2000:2310-2.
  2. Gellatly SL, Hancock RE. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 2013;67:159-173.
  3. Driscoll JA, Brody SL, Kollef MH. The epidemiology, pathogenesis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections. Drugs. 2007;67:351-368.
  4. Chatterjee M, Anju CP, Biswas L, et al. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. Int J Med Microbiol. 2016;306:48-58.
  5. Sriramulu DD, Lünsdorf H, Lam JS, Römling U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J Med Microbiol. 2005;54:667-676.
  6. Williams BJ, Dehnbostel J, Blackwell TS. Pseudomonas aeruginosa: host defence in lung diseases. Respirology. 2010;15:1037-1056.
  7. Richards MJ, Edwards J, Culver DH, Gaynes RP. Nosocomial infections in medical intensive care units in the United States. National Nosocomial Infections Surveillance System. Crit Care Med. 1999;27:887-892.
  8. Jarvis WR. Epidemiology of nosocomial fungal infections, with emphasis on Candida species. Clin Infect Dis. 1995;20:1526-1530.
  9. Donlan RM. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 2001;7:277-281.
  10. Calvet E, Prat H. Recent progress in microcalorimetry. Ed. Macmillan. 1963..
  11. Wadsö I. Isothermal microcalorimetry in applied biology. Thermochimica Acta. 2002;394(1-2):305-311.
  12. Braissant O, Wirz D, Göpfert B, Daniels AU. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiol Lett. 2010;303:1-8.
  13. Trampuz A, Steinhuber A, Wittwer M, Leib SL. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospinal fluid. BMC Infect Dis. 2007;7:116.
  14. James AM. Thermal and energetic studies of cellular biological systems. Bristol, UK:. Ed. Wright; 1987. 4.
  15. Holmes C J, Plichta JK, Gamelli RL, Radek KA. Dynamic role of host stress responses in modulating the cutaneous microbiome: implications for wound healing and infection. Adv Wound Care. 2015;4(1):24-37.
  16. Assadian O, Assadian A, Stadler M, et al. Bacterial growth kinetic without the influence of the immune system using vacuum-assisted closure dressing with and without negative pressure in an in vitro wound model. Int Wound J. 2010;7(4):283-289.
  17. Zimmerli W, Trampuz A, Ochsner PE. Prosthetic-joint infections. N Engl J Med. 2004;351:1645-1654..
  18. Osmon DR, Berbari EF, Berendt AR, et al. Diagnosis and management of prosthetic joint infection: clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2013;56(1):e1-e25..
  19. Agostinho A, Renzi G, Haustein T, et al. Epidemiology and acquisition of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in a septic orthopedic ward. Springerplus. 2013;2(1):91.
  20. Al-Mayahi M, Cian A, Kressmann B, et al. Associations of diabetes mellitus with orthopaedic infections. Infect Dis. 2016;48:70-3.
  21. Hidron AI, Edwards JR, Patel J, et al. Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006-2007. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008;29:996-1011.

Articole din ediţiile anterioare

STUDII CLINICE | Ediţia 1 53 / 2018

Microcalorimetria, utilitate şi reproductivitate în diagnosticul infecţiilor ortopedice cu Staphylococcus aureus

Mihnea Gabriel Popa, Răzvan Ene, Vlad Tudor Popa, Cristiana Cerasella Dragomirescu, Adriana Muntean, Cătălin Cîrstoiu, Miron Alexandru Bogdan, Adrian Streinu-Cercel

Intervenţiile în sfera ortopediei şi traumatologiei presupun din ce în ce mai frecvent utilizarea materialelor de osteosinteză şi a protezelor; ast...

24 aprilie 2018
JOURNAL CLUB | Ediţia 2 54 / 2018

Vaccin pentru prevenirea şi tratarea infecţiilor produse de Pseudomonas aeruginosa

Mădălina Preda

Pseudomonas aeruginosa poate fi implicată în numeroase patologii (de la pneumonie asociată ventilaţiei la infecţia leziunilor apărute în urma arsur...

26 iunie 2018
PREZENTARE DE CAZ | Ediţia 3 51 / 2017

Infecţie cu Pseudomonas aeruginosa la un pacient cu particularităţi de anestezie și terapie intensivă din chirurgia cervicală

Olimpia Iulia Zoican, Mădălina Preda, Răzvan Hainăroșie, Viorel Zainea, Romeo Călărașu

În apariția cancerelor orale și orofaringiene s-a observat prezența unor caracteristici, fiind mai frecvente la persoanele în vârstă, consumatoare ...

06 noiembrie 2017
PREZENTARE DE CAZ | Ediţia 3 51 / 2017

Infecţie recurentă cu Pseudomonas aeruginosa la nivelul unui ulcer venos cronic

Mădălina Irina Mitran, Cristina Iulia Mitran, Mircea Tampa, Maria Isabela Sârbu, Alexandra Mihaela Popa, Simona Roxana Georgescu

Ulcerele venoase cronice ale membrelor inferioare reprezintă o importantă problemă de sănătate publică, având un impact semnificativ asupra calităț...

06 noiembrie 2017