STUDII CLINICE

Microcalorimetria, utilitate şi reproductivitate în diagnosticul infecţiilor ortopedice cu Staphylococcus aureus

 Microcalorimetry, utility and reproducibility in the diagnosis of orthopaedic infections with Staphylococcus aureus

First published: 24 aprilie 2018

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Inf.53.1.2018.1610

Abstract

Interventions in the field of orthopaedics and traumatology involve increasingly use of osteosynthesis materials and prostheses; so an increasing number of patients live with these implants, with an increased risk to develop an infection at the surgery site in comparison to general population.
Numerous micro-organisms have been identified in these infections, notably is Staphylococcus aureus. This can result in prolonged infections very difficult to treat, many cases requiring ablation of the implant to achieve a correct treatment of the infection site.
Rapid identification of an infection is the key to establish the right treatment. We would like to highlight the possibility of rapid identification of infections using microcalorimetry. This method can describe in real time the bacterial multiplication curves according to the electrical signal transmitted by them. By overlapping the curves generated by the different microbial strains, we can generate a useful algorithm for a quick and efficient identification.

Keywords
microcalorimetry, orthopaedics, Staphylococcus aureus

Rezumat

Intervenţiile în sfera ortopediei şi traumatologiei presupun din ce în ce mai frecvent utilizarea materialelor de osteosinteză şi a protezelor; astfel, un număr din ce în ce mai mare de pacienţi trăiesc cu aceste implanturi, având un risc crescut faţă de populaţia generală de a dezvolta o infecţie la locul intervenţiei.
Numeroase microorganisme au fost identificate în aceste infecţii, de remarcat fiind Staphylococcus aureus. Acesta poate genera infecţii trenante foarte dificil de tratat, în multe cazuri fiind necesară ablaţia implantului pentru realizarea unei asanări corecte a focarului infecţios.
Identificarea rapidă a unei infecţii este cheia stabilirii unui tratament corect. Dorim să punem în lumină posibilitatea identificării rapide a infecţiilor, utilizând microcalorimetria. Această metodă poate să descrie în timp real curbele de multiplicare bacteriană conform semnalului electric transmis de acestea. Prin suprapunerea curbelor generate de diferitele tulpini microbiene, putem genera un algoritm util în identificare, rapid şi eficient. 

Introducere

Patologia infecţioasă reprezintă o problemă importantă a sistemelor de sănătate. În cazul ortopediei, dar şi a celorlalte specialităţi chirurgicale, infecţia unei plăgi se însoţeşte de încetinirea procesului de vindecare şi de o semnificativă creştere a stresului experimentat de pacient. Pacienţii descriu dureri crescute în comparaţie cu cei care, având aceeaşi patologie, s-au vindecat fără o infecţie asociată(1,2). Diagnosticul corect şi rapid, urmat de un tratament adecvat, este esenţial în acest tip de patologie, deoarece infecţia unei plăgi operatorii, mai ales în cazul artroplastiilor sau al folosirii implantelor ortopedice, poate să conducă la efecte dezastruoase; în majoritatea cazurilor este necesară îndepărtarea materialului străin. Toate procesele infecţioase apărute postoperator întrerup procesul normal de vindecare, determină o creştere a riscului apariţiei unor patologii asociate sau decompensări ale celor preexistente, dar în acelaşi timp prelungesc timpul de spitalizare cu costuri suplimentare în cadrul sistemelor de sănătate(3).

Numărul intervenţiilor chirurgicale în sfera ortopedică în care se folosesc implanturi cunoaşte o creştere accelerată în ultima decadă. În viitor, pacienţii cu diferite implanturi vor fi din ce în ce mai numeroşi. Procesul prin care bacteriile ajung la nivelul implanturilor este unul complex; sursa infecţiei putând fi un implant contaminat, erori în cursul procesului chirurgical, tulburări de vindecare a rănilor de diferite etiologii, infecţii la distanţă cu diseminare hematogenă. Din aceste considerente, în cazul intervenţiilor chirurgicale plănuite este obligatoriu să investigăm, să identificăm şi să tratăm orice focar infecţios prezent la distanţă. Sunt studii care descriu o rată de 2-3 ori mai mare de infecţie la pacienţii cu un abces dentar sau o patologie infecţioasă la nivelul pielii sau al tubului digestiv(4,5).

Există numeroşi agenţi microbieni care pot să determine infecţii în sfera ortopedică. Dintre aceştia trebuie să amintim: Staphylococcus aureus (S. aureus), stafilococii coagulază-negativi, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa. S. aureus reprezintă bacteria cea mai frecvent întâlnită în acest tip de infecţii(6).

Implicarea S. aureus în sfera ortopedică este dată în primul rând de capacitatea acestuia de a se cantona la nivelul matricei osoase prin multiple componente de adeziune; în plus, S. aureus poate să se localizeze intracelular. Internalizarea îi oferă protecţie faţă de sistemul imun şi tratamentul antibiotic(7). De remarcat şi capacitatea de a forma biofilme pe suprafaţa implanturilor, intrând într-o stare „dormantă“, cu metabolism scăzut, rezistent faţă de sistemul imun al gazdei. Această patologie este din ce în ce mai frecventă din cauza numărului mare de implanturi ortopedice sau cardiovasculare(8,9).

Alţi factori de risc ce trebuie monitorizaţi sunt: diabetul zaharat şi consumul de tutun. S-a demonstrat că niveluri ridicate ale glicemiei în primele 48 de ore postoperator sunt asociate cu risc crescut de infecţii la locul operaţiei. Fumatul este asociat cu încetinirea vindecării plăgilor, motiv pentru care pacientului trebuie să i se explice importanţa eliminării acestei dependenţe sau cel puţin stoparea pentru 30 de zile preoperator(10,11).

Intervenţia chirurgicală în sine poate fi considerată un factor de risc. O hemostază corect realizată, care să împiedice formarea seroamelor sau a hematoamelor, asociată cu o îndepărtare a ţesuturilor devitalizate şi atenta manevrare a ţesuturilor cu minimizarea leziunilor, este un factor foarte important, care trebuie luat în considerare în abordarea oricărui pacient. Administrarea unei medicaţii antimicrobiene, de scurtă durată, este recomandată imediat înainte de intervenţie. S-a demonstrat că efectul este maximal dacă este introdusă cu 30 de minute înainte de incizie(12).

Microcalorimetria, ca ştiinţă, datează încă din secolul al 18-lea, când microcalorimetrele s-au folosit pentru înregistrarea căldurii emise de diferite animale mici. Au devenit din ce în ce mai sofisticate şi cu posibilităţi diverse de a înregistra temperaturile produse în relaţie cu ele şi cu mediul înconjurător. Un tip de microcalorimetrie care prezintă interes pentru lumea medicală este microcalorimetria izotermă. Este vorba despre un instrument de măsurare a căldurii degajate, putând fi înregistrate valori de ordinul microwaţilor (µW=µJ/s), reuşind să păstreze o temperatură constantă pe tot parcursul experimentului. Microcalorimetrul conţine module termoelectrice care sunt montate la nivelul zonelor de înregistrare, atât în zona în care se plasează proba, cât şi în zona în care se plasează referinţa. Căldura produsă şi consumată poate să circule liber între aceste module care înregistrează fiecare modificare, generând o curbă calorimetrică ce poate fi interpretată în timpul experimentului sau la finalul acestuia(13).

Tehnicile de microcalorimetrie pot înregistra, ipotetic, temperatura degajată de orice organism viu, în care se desfăşoară procese biologice care produc căldură. De exemplu, calorimetria a fost folosită pentru a realiza studii asupra diferitelor materii biologice(14) sau a creşterii paraziţilor(15), dar şi pentru a detecta infecţiile. În experimentele realizate de echipa noastră, căldura degajată de microorganism este singurul parametru esenţial. Având aceste considerente putem să ne gândim la microcalorimetrie ca la o tehnică realizată în diferite condiţii, fie că vorbim de mediul folosit sau de proprietăţile fizice ale acestuia. De exemplu putem să realizăm experimente atât în mediul aerob, cât şi în mediul anaerob, pe medii care pot să fie solide, lichide sau în stare de gel(16,17).

Material şi metode

Pentru realizarea experimentelor, echipa a utilizat două aparate de microcalorimetrie care au mecanism de scanare diferenţial, iar pentru a proteja senzorul 3D am folosit Argon pur în stare gazoasă (99,99% SIAD - TP). În cadrul experimentelor, probele şi referinţele au fost introduse în celule microcalorimetrice de 1 ml.

Populaţia bacteriană

Microorganismele studiate au fost recoltate de la pacienţi internaţi pe Secţia de ortopedie şi traumatologie a Spitalului Universitar de Urgenţă Bucureşti. Am studiat trei tulpini diferite de Staphylococcus aureus recoltate intraoperator de la nivelul unor colecţii purulente.

Mediul de cultură

Am utilizat agarul Müller-Hinton (MH) folosit atât pentru izolarea microorganismelor, cât şi pentru realizarea antibiogramelor. Este compus din extract de proteină animală (2,0 g), hidrolizat de cazeină (17,5 g), amidon (1,5 g), agar (17 g), diluate într-un litru de apă distilată, iar pH-ul a fost adus la valoare neutră, la 25ºC. Fiecare lot este verificat pentru sterilitate şi eficienţă.

S-a preferat utilizarea acestui mediu pentru că permite dezvoltarea majorităţii microorganismelor. În plus, datorită conţinutului în amidon, poate să absoarbă toxine eliberate de bacterii pentru a nu interfera cu posibilul antibiotic adăugat.

Rezultate

Tulpinile de S. aureus au fost extrase în sala de operaţie într-un mediu steril şi inoculate pe MH pentru obţinerea coloniilor izolate. S-au realizat diagnosticul microbiologic clasic şi tehnicile microcalorimetrice.

Toate experimentele microcalorimetrice au fost realizate folosind probe de 0,6 ml la 37ºC, pentru că în urma altor studii, realizate de echipa noastră în trecut, am ajuns la concluzia că acestea sunt cantitatea şi temperatura optimă(16,17). Toate experimentele au folosit aceeaşi concentraţie bacteriană şi acelaşi mediu de creştere. Pentru a reuşi o standardizare a concentraţiei bacteriene am folosit un aparat de nefelometrie în care am introdus iniţial mediul pur (valoare nefelometrică 0,18), după care am adăugat concentrat bacterian până la valoarea de 0,3. Am realizat o diluţie pentru obţinerea unei valori de 105 bacterii/ml.

Pentru a evalua corect curbele de creştere am propus câţiva parametri utili, şi anume: linia de bază izoelectrică la începutul experimentului şi întoarcerea la această linie la sfârşitul său, vârful maxim de creştere atins de bacterie, detecţia semnalului termic şi stabilirea creşterii exponenţiale. Folosind aceşti parametri, putem să caracterizăm termograme brute ale creşterilor bacteriene sau să facem diferenţierea între microorganisme.

Pentru toate cele trei microorganisme am realizat câte două termograme în aceleaşi condiţii de mediu şi de temperatură, neexistând modificări notabile între cele două experimente distincte. Am suprapus aceste termograme şi, asa cum se poate observa din imaginile asociate, rezultatele sunt foarte asemănătoare atât în cazul aceleiaşi tulpini, cât şi între cele trei tulpini (figura 1, figura 2, figura 3). Timpul necesar pentru multiplicarea bacteriană şi temperaturile generate de acestea au fost asemănătoare în toate experimentele, confirmându-ne teoria iniţială.

Discuţii

În cadrul acestui studiu am evaluat creşterea S. aureus, însă considerăm că rezultatele se pot extrapola pentru alte baterii anaerobe sau aerobe. Aşa cum se poate observa în figurile prezentate, intervalul de timp după care putem să spunem că este vorba despre S. aureus nu depăşeşte 15-20 de ore (figura 1, figura 2, figura 3). Fiind vorba despre o înregistrare în timp real, există posibilitatea ca, după ce se va realiza o standardizare a metodei, însoţită de acumularea unui număr suplimentar de experimente, să se reuşească identificarea bacteriană înainte ca bacteria să dezvolte o curbă de creştere completă. Având în vedere numărul limitat de tulpini studiate, noi experimente sunt necesare până la punerea la punct a unei metode de diagnostic implementabile în spitale. Aşa cum se poate observa, cu toate că discutăm despre trei tulpini bacteriene diferite, extrase de la trei pacienţi diferiţi, curbele microcalorimetrice sunt foarte asemănătoare, cu mici devieri. Avem în obiective stabilirea unui algoritm care să compare diferite curbe de creştere.
 

Figura 1. Staphylococcus aureus proba nr. 1 – Termogramă – recoltare intraoperatorie de la nivelul unui abces de coapsă
Figura 1. Staphylococcus aureus proba nr. 1 – Termogramă – recoltare intraoperatorie de la nivelul unui abces de coapsă
Figura 2. Staphylococcus aureus proba nr. 2 – Termogramă – recoltare intraoperator de la nivelul unei colecţii periprotetice de la nivelul şoldului
Figura 2. Staphylococcus aureus proba nr. 2 – Termogramă – recoltare intraoperator de la nivelul unei colecţii periprotetice de la nivelul şoldului
Figura 3. Staphylococcus aureus proba nr. 3 – Termogramă – recoltare intraoperator de la nivelul unui proces septic dezvoltat posttraumatic
Figura 3. Staphylococcus aureus proba nr. 3 – Termogramă – recoltare intraoperator de la nivelul unui proces septic dezvoltat posttraumatic

Prin analiza semnalului termic şi prin optimizarea cineticii multiplicării bacteriene, asociată cu o standardizare a experimentelor, considerăm că această metodă reprezintă un instrument potent atât pentru cercetare, cât şi pentru diagnostic. Metoda de diagnostic oferă un potenţial imens în cazul patologiei infecţioase în oricare dintre domeniile medicale, nu numai în ortopedie.

Concluzii

Din cauza creşterii numărului de implanturi şi metode de osteosinteză internă, un număr din ce în ce mai mare de pacienţi prezintă risc de infecţie.

Pentru un tratament corect, toate procesele infecţioase trebuie să fie depistate timpuriu şi tratate corespunzător, etiologic. Ca atare, dezvoltarea unor noi metode de diagnostic rapid care să fie şi eficiente este foarte necesară. Dacă tratamentul este realizat corect, pacientul se va vindeca rapid, fără complicţii, costurilor asupra sistemelor de sănătate scad, iar integrarea sa în societate va fi rapidă, toate aceste aspecte având beneficii economice.

Microcalorimetria este o metodă puţin folosită în prezent în identificarea agenţilor patogeni implicaţi în infecţii, dar are un potenţial real şi valoros.

Sunt necesare experimente suplimentare, corelate cu metode de analiză a curbelor de multiplicare bacteriană, pentru obţinerea unui rezultat optim şi reproductibil. 

Bibliografie

  1. Bjarnsholt T, Kirketerp-Moller K, Jensen P, et al. Why chronic wounds will not heal: a novel hypothesis. Wound Repair Regen. 2008;16:2-10.
  2. Soon K, Acton C. Paininducedvstress: a barrier to wound healing. Wounds UK. 2006;2(4):92-101.
  3. Rhoads DD, Wolcott RD, Percival SL. Biofilms in wounds: management strategies. J Wound Care. 2008;17(11):502-508.
  4. Schneeberger PM, Smits MH, Zick RE, Wille JC. Surveillance as a starting point to reduce surgical-site infection rates in elective orthopaedic surgery. J Hosp Infect. 2002;51(3):179.
  5. Buxton TB, et al. Low-dose infectivity of Staphylococcus aureus (SMH strain) in traumatized rat tibiae provides a model for studying early events in contaminated bone injuries. Comp Med. 2005;55(2):123-8
  6. Wong ES. Surgical site infections. Hospital epidemiology and infection control. Baltimore: Williams & Wilkins; 2004.
  7. Valour F, Trouillet-Assant S, Riffard N, et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2015;59:2029-36.
  8. Mihailescu R, Furustrand Tafin U, Trampuz A, et al. High Activity of Fosfomycin and Rifampin against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Biofilm In Vitro and in an Experimental Foreign-Body Infection Model. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58(5):2547-2553.
  9. Baldoni D, Steinhuber A, Trampuz A, et al. In Vitro Activity of Gallium Maltolate against Staphylococci in Logarithmic, Stationary, and Biofilm Growth Phases: Comparison of Conventional and Calorimetric Susceptibility Testing Methods. Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54(1):157-163.
  10. Sloan A, Hussain I, Maqsood M, et al. The effects of smoking on fracture healing. Surgeon. 2010;8(2):111-6.
  11. Retzepi M, Donos N. The effect of diabetes mellitus on osseous healing. Clin Oral Impl Res. 2010;21:673-81.
  12. Kernodle DS, Kaiser AB. Postoperative infections and antimicrobial prophylaxis. In: Mendel GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principles and practice of infectious diseases. Philadelphia: Churchill Livingstone. 2000;3177-91.
  13. Braissant O, Wirz D, Gopfert B, et al. Biomedical Use of Isothermal Microcalorimeters. Sensors. 2010;10(10):9369-83.
  14. Doostmohammadi A, Monshi A, Fathi MH, Karbasi S. Direct cytotoxicity evaluation of 63S bioactive glass and bone-derived hydroxyapatite particles using yeast model and human chondrocyte cells by microcalorimetry. J Mater Sci Mater Med. 2011;22:2293-2300.
  15. Keiser J, Manneck T, Kirchhofer C, Braissant O. Isothermal microcalorimetry to study the activity of triclabendazole and its metabolites on juvenile and adult Fasciola hepatica. Exp. Parasitol. 2013;133:265-268.
  16. Zaharia DC, Iancu C, Steriade AT, Muntean AA, Balint O, Popa VT, Popa MI, Bogdan MA. MicroDSC study of Staphylococcus epidermidis growth. BMC Microbiol. 2010;10:322.
  17. Zaharia DC, Popa MG, Steriade AT, Muntean AA, Balint O, Micuţ R, Popa VT, Popa MI, Bogdan MA. Microcalorimetry - a new method for bacterial characterisation. Pneumol. 2013;62(4):232-5.

Articole din ediţiile anterioare

PREZENTARE DE CAZ | Ediţia 1 49 / 2017

Microcalorimetria – o metodă cu potenţial în diagnosticul infecţiilor ortopedice

Mihnea Gabriel Popa, Zsombor Panti, Mihai Nica, Marian Pleniceanu, Anda Băicuș, Vlad Tudor Popa, Răzvan Ene, Cătălin Cîrstoiu

Microcalorimetry – a promising method for the diagnosis of orthopedic infections Suggested citation for this article: Popa MG, Panti Z, Nica M, et...

26 aprilie 2017
PREZENTĂRI DE CAZ | Ediţia 3 / 2016

O evoluţie atipică a unei infecţii cutanate cu Staphylococcus aureus

Romina-Marina Sima

Staphylococcus aureus este un coc Gram‑pozitiv, frecvent localizat la nivel nazal, în tractul respirator sau la nivel cutanat. A fost identificat p...

16 iulie 2016
PREZENTĂRI DE CAZ | Ediţia 2 54 / 2018

Posibilitatea diagnosticului infecţiilor ortopedice folosind microcalorimetria

Mihnea Gabriel Popa, Răzvan Ene, Vlad Tudor Popa, Cristiana Cerasella Dragomirescu, Corina Panaitescu, Andrei-Alexandru Muntean, Cătălin Cîrstoiu, Adrian Streinu-Cercel

Utilizarea implanturilor medicale devine o practică foarte frecventă în era noastră, datorită numeroaselor beneficii. În cadrul ortopediei şi traum...

26 iunie 2018
SINTEZE | Ediţia 3 / 2016

Enterotoxina stafilococică B – agent potenţial de bioagresiune

Cristiana Cerasella Dragomirescu, Mircea Ioan Popa, Ileana Luminiţa Coldea

Staphylococcus aureus (S. aureus), microorganism condiţionat patogen, constituent al microbiotei normale la om și animale, poate determina infecţii...

16 iulie 2016