CERCETARE

Efectul osteoprotector al simvastatinei prin prisma studiilor spectroscopice în VIS-IR

 The osteoprotective effect of simvastatin from the perspective of VIS-nearIR spectrometric studies

First published: 27 aprilie 2020

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Med.134.2.2020.3116

Abstract

Introduction. Osteoporosis and dyslipidemia are two patho­logical conditions that commonly occur together, given the common risk factors. This is why it is important not only to choose the appropriate medication that does not have negative side effects on the comorbidities, but when possible, to choose a medication which may bring benefits for many pathologies. Dyslipidemia responds well to hypolipidemic medication, and data from literature show that simvastatin, in addition to the hypolipidemic ef­fect, has also a beneficial effect on bone metabolism. Aim. The purpose of this study is to evaluate the effects of simvastatin on bone healing, respectively the correlation of these effects with the literature data. Materials and method. The study was performed on rats divided into two groups, ovarectomized and neovarectomized, each in turn having two groups, control and treated with sim­va­sta­tin. Calus evaluation was performed using VIS-nearIR spectrometry to examine hematoxiline eosine (HE) his­to­lo­gi­cal stained preparations at different post-frac­ture periods, respectively 2, 4, 6 and 8 weeks. Results. We observed a decrease of the osteogenic potential in the groups of ovarectomized rats compared to the neo­va­rec­to­mized ones. At the same time, it was also observed an increased osteogenic potential in the groups treated with simvastatin compared with the control group within the group of ovarectomized rats. Conclusions. The difference in osteogenic potential between the two groups underscores the importance of estrogen in the bone healing process. Simvastatin plays a beneficial role in the process of osteogenesis, given the difference between the treated and untreated groups in each group of rats.

Keywords
osteoporosis, simvastatin, bone healing

Rezumat

Introducere. Osteoporoza şi dislipidemia sunt două condiţii patologice care apar frecvent împreună, având în vedere fac­torii de risc comuni. De aceea este importantă nu doar alegerea medicaţiei corespunzătoare care să nu aibă efecte secundare negative asupra comorbidităţilor, dar, atunci când este posibil, trebuie să fie aleasă acea medicaţie care poate aduce beneficii pentru mai multe patologii. Dislipidemia răspunde foarte bine la me­di­caţia hipolipemiantă, iar da­te­le din literatură arată că simvastatina, pe lângă efectul hi­po­li­pe­miant, are un efect be­­ne­­fic şi asupra metabolismului osos. Obiectiv. Scopul aces­tui studiu constă în evaluarea efectelor simvastatinei asu­pra vindecării osoase, respectiv corelarea acestor efecte cu datele din literatură. Materiale şi metodă. Studiul a fost efec­tuat pe şobolani împărţiţi în două grupuri, ovarectomizat şi neovarectomizat, fiecare la rândul lui având două loturi, mar­tor şi tratat cu simvastatină. Evaluarea ca­lu­sului s-a fă­cut folosind spectrometria în VIS-IRapropiat pentru exa­mi­na­rea preparatelor histologice colorate cu hematoxilină eo­zină (HE) la diferite perioade postfractură, respectiv 2, 4, 6 şi 8 săp­tă­mâni. Rezultate. Am observat o scădere a po­ten­ţia­lului os­teo­gen în grupurile de şobolani ovarectomizaţi com­pa­rativ cu cei neovarectomizaţi. S-a observat un potenţial os­teo­gen cres­cut şi în cazul loturilor tratate cu simvastatină, com­pa­ra­tiv cu lotul-martor din ca­drul grupului de şobolani ova­rec­to­mi­zaţi. Concluzii. Di­fe­renţa de potenţial osteogen din­tre cele două grupuri, ovarectomizat şi neovarectomizat, sub­li­niază im­por­tan­ţa estrogenilor în cadrul procesului de ca­lu­sa­re. Sim­va­sta­ti­na are un rol benefic asupra procesului de osteo­ge­ne­ză, dată fiind diferenţa dintre loturile tratate şi cele netratate din cadrul fie­cărui grup de şobolani.

Introducere

Boală a sistemului osos, osteoporoza se caracterizează prin masa osoasă scăzută şi deteriorarea microarhitecturală a ţesutului osos, având drept consecinţă creşterea continuă a fragilităţii osoase şi a susceptibilităţii la fracturi(1).

Din punct de vedere fiziopatologic, se pot descrie două mecanisme importante în cadrul osteoporozei, sinteza şi reabsorbţia osoasă, care, în mod normal, sunt strâns legate între ele. Aceste două mecanisme sunt reglate de anumiţi factori, cum ar fi hormonul paratiroidian, calcitonina, estrogenii, vitamina D şi anumite citokine (IL-1, IL-6, TNF) necesare pentru activitatea osteoblastică şi cea osteoclastică(2).

Osteoporoza se poate clasifica în două mari categorii: primară şi secundară. Osteoporoza primară este cea mai comună formă de boală şi include osteoporoza de tip I (postmenopauză), respectiv osteoporoza de tip II (senilă sau involuţională). Osteoporoza secundară se caracterizează ca având un mecanism etiologic clar definit(3).

Osteoporoza afectează peste 200 de milioane de femei din întreaga lume, incidenţa ei crescând odată cu vârsta(4). Menopauza are un rol determinant pentru această creştere a incidenţei. Osteoporoza din postmenopauză este cauzată de activitatea crescută a osteoclastelor. Acest mecanism este precipitat de scăderea nivelului estrogenilor, care duce la creşterea nivelului citokinelor, cu rol de recrutare şi activare a osteoclastelor la nivelul osului trabecular, rezultând o reabsorbţie osoasă crescută(2).

Conform studiilor(5), estrogenii au un efect benefic asupra metabolismului osos, menţinând masa osoasă printr-un mecanism antiresorbtiv. Acest mecanism se explică prin efectul direct al estrogenilor asupra osului, conform căruia estrogenii induc inhibarea resorbţiei osoase de către osteoclaşti prin activarea liniei celulare a osteoblaştilor.

Manifestarea clinică a osteoporozei constă în fracturile care apar ca o complicaţie a acestei afecţiuni, precum şi în morbiditatea şi mortalitatea asociate acestora. Cei mai importanţi factori de risc din punctul de vedere al fracturilor osteoporotice sunt: sexul feminin, menopauza precoce, vârsta înaintată, fracturile de fragilitate în antecedente, densitatea minerală osoasă scăzută, deficienţa de vitamină D(6).

Dislipidemia, fiind o afecţiune care se caracterizează prin alterarea metabolismului grăsimilor din organism, evidenţiată prin modificarea valorilor LDL-colesterolului, HDL-colesterolului şi trigliceridelor, are factori de risc similari osteoporozei. Apariţia ambelor boli depinde practic de stilul de viaţă, de factori genetici, metabolici, nutriţionali şi hormonali(7).

Tratamentul de elecţie al dislipidemiei este cel reprezentat de medicaţia hipolipemiantă. Statinele, inhibitori ai 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzimei A (HMG-CoA) reductază, constituie o clasă puternică de medicamente hipolipemiante disponibile în prezent(8). Există studii care au arătat faptul că simvastatinele ar avea efect şi asupra metabolismului osos, stimulând activitatea osteoblastelor, celule osoase tinere, nediferenţiate, din care se formează osteocitul, stimulând astfel şi formarea de os nou(9).

Figura 1. Imagine a unui preparat histologic folosit pen­tru  a demonstra asocierea culorii ţesuturilor (fibros, osos şi hematogen) şi a nucleelor celulare cu lungimea de undă λ
Figura 1. Imagine a unui preparat histologic folosit pen­tru a demonstra asocierea culorii ţesuturilor (fibros, osos şi hematogen) şi a nucleelor celulare cu lungimea de undă λ

Obiectiv

Scopul acestui studiu este evaluarea efectelor simvastatinei asupra vindecării osoase în cazul fracturilor osteoporotice.

Materiale şi metodă

S-a realizat un studiu experimental pe două grupuri de câte 24 de şobolani Wistar, femele, unul neovarectomizat şi altul ovarectomizat. Fiecare grup de şobolani a fost împărţit, la rândul lui, în două loturi, martor, respectiv lot tratat cu simvastatină. Toate animalele au suferit o fractură de femur posterior drept, mediodiafizară, care a fost stabilizată cu o tijă intramedulară. În cazul grupului de şobolani ovarectomizaţi, fractura s-a produs la 12 săptămâni postovarectomie, timp necesar pentru apariţia osteoporozei. Simvastatina a fost administrată prin gavaj într-o doză zilnică de 10 mg/kg. Pentru evaluarea procesului de calusare postfractură s-a folosit o metodă fizică de cuantificare a vindecării prin evaluarea preparatelor histologice colorate cu hematoxilină eozină, cu ajutorul spectroscopiei VIS-IRapropiat. Astfel, cercetarea se bazează pe interacţiunea dintre lumină şi materie, în particular pe studiul absorbţiei luminii, la trecerea prin diferite probe de studiat, în funcţie de lungimea de undă, l, adică a culorii acesteia. Astfel, spectroscopia în vizibil şi infraroşu apropiat (VIS-IRapropiat) a fost folosită pentru cuantificarea cantităţii din fiecare ţesut specific (fibros, osos, hematogen şi nuclee celulare) din preparatele histologice puse în evidenţă de coloraţia HE.

Probele au fost recoltate la 2, 4, 6 şi la 8 săptămâni postfractură, iar măsurătorile au fost efectuate folosind un spectrometru VIS-IRapropiat de tip Pasco.

Rezultate

La primul pas s-a efectuat o analiză optică a preparatelor histologice colorate în HE, care a permis identificarea intervalelor de lungimi de undă pentru cuantificarea ţesutului hematogen, ţesutului fibros, a celui osos şi a nucleelor celulare (figura 1). La pasul al doilea s-au înregistrat spectrele VIS-IRapropiat pentru toate preparatele. În final, s-a scris un program în MatCad pentru analiza spectrelor VIS-IRapropiat, care a permis cuantificarea celor patru tipuri de ţesut prin măsurarea ariilor integrale pentru fiecare domeniu spectral determinat în pasul I.

Obiectivizarea (cuantificarea) evaluării procesului de calusare prin analiza preparatelor histologice colorate cu HE cu ajutorul spectrometriei VIS-IRapropiat a permis evaluarea efectului simvastatinei asupra procesului de calusare prin prisma evoluţiei celularităţii şi a ţesutului fibros, respectiv osos pe preparatele histologice. Astfel, în cazul grupurilor ovarectomizate, atât în cazul lotului-martor, cât şi în cel tratat cu simvastatină, s-a putut observa o scădere a potenţialului osteogen (figura 2) comparativ cu grupurile neovarectomizate (figura 3) în perioada formării calusului osos, adică în intervalul cuprins între săptămânile 4 şi 6. Această constatare este susţinută şi de alte studii care arată rolul şi importanţa estrogenilor în activarea osteoblastelor şi inhibarea osteoclastelor(5).

Rolul favorabil al simvastatinei în ceea ce priveşte procesul de osteogeneză este dovedit de potenţialul osteogen crescut al loturilor tratate cu simvastatină faţă de lotul-martor. Acesta este vizibil atât în perioada de formare a calusului dur, intervalul 4-6 săptămâni, cât şi în etapa următoare de remodelare a acestuia, intervalul 6-8 săptămâni, atât în cazul grupului ovarectomizat (figura 2), cât şi în cazul celui neovarectomizat (figura 3).
 

​Figura 2. Raportul procentual al ariilor integrale de ţesut hematogen per nuclee celulare şi ţesut h​
​Figura 2. Raportul procentual al ariilor integrale de ţesut hematogen per nuclee celulare şi ţesut h​
Figura 3. Raportul procentual al ariilor integrale de ţesut hematogen per nuclee celulare şi ţesut hematogen prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii neovarectomizaţi din lotul-martor (NOVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (NOVX-S-HE). Din punctul de vedere al evoluţiei celularităţii şi implicit al potenţialului osteogen, evaluarea celularităţii la 8 săptămâni arată valori mai scăzute în cazul grupurilor neovarectomizate (figurile 2, 3) faţă de cele ovarectomizate. Acest lucru sugerează o activitate osteoclastică redusă, arătând faptul că obţinerea calusului definitiv este mai precoce în cazul grupului neovarectomizat
Figura 3. Raportul procentual al ariilor integrale de ţesut hematogen per nuclee celulare şi ţesut hematogen prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii neovarectomizaţi din lotul-martor (NOVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (NOVX-S-HE). Din punctul de vedere al evoluţiei celularităţii şi implicit al potenţialului osteogen, evaluarea celularităţii la 8 săptămâni arată valori mai scăzute în cazul grupurilor neovarectomizate (figurile 2, 3) faţă de cele ovarectomizate. Acest lucru sugerează o activitate osteoclastică redusă, arătând faptul că obţinerea calusului definitiv este mai precoce în cazul grupului neovarectomizat

Urmărirea cantitativă a ţesutului osos în cadrul procesului de calusare a arătat faptul că simvastatina în prezenţa estrogenului, adică în cazul grupului neovarectomizat, stimulează producţia de ţesut osos. Acest lot are cea mai mare cantitate de ţesut osos la finalul etapei de calus dur, în săptămâna a şasea (figurile 4, 5).

Cantitatea de ţesut osos la sfârşitul celor 8 săptămâni este aproximativ egală în cadrul grupului neovarectomizat (figura 4), în ambele loturi, martor şi cu tratament cu simvastatină, fiind mai mare decât cea din cadrul grupului ovarectomizat (figura 5), unde am măsurat, de asemenea, o cantitate aproximativ egală de ţesut osos în cadrul celor două loturi. Corelarea potenţialului osteogen celular cu producerea de ţesut osos este demonstrată de analiza comparativă a figurilor 2 şi 5, observându-se o scădere a cantităţii de ţesut osos în perioada formării calusului dur, perioada 4-6 săptămâni, pe fondul activităţii osteoclastice crescute şi al activităţii osteoblastice scăzute, determinate de nivelul scăzut al estrogenului.

Figura 4. Raportul procentual al ariilor integrale ţesut osos per ţesut fibros şi ţesut osos prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii neovarectomizaţi din lotul-martor (NOVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (NOVX-S-HE)
Figura 4. Raportul procentual al ariilor integrale ţesut osos per ţesut fibros şi ţesut osos prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii neovarectomizaţi din lotul-martor (NOVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (NOVX-S-HE)
Figura 5. Raportul procentual al ariilor integrale ţesut osos per ţesut fibros şi ţesut osos prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii ovarectomizaţi din lotul-martor (OVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (OVX-S-HE)
Figura 5. Raportul procentual al ariilor integrale ţesut osos per ţesut fibros şi ţesut osos prezentat în funcţie de timpul de calusare (2, 4, 6 şi 8 săptămâni) pentru şobolanii ovarectomizaţi din lotul-martor (OVX-M-HE) şi lotul tratat cu simvastatină (OVX-S-HE)

Discuţie

Rezultatele din literatură arată faptul că efectul benefic al statinelor asupra procesului de calusare este dependent de doză şi de modul de administrare a medicamentului. Astfel, conform unui studiu(10) efectuat pe şobolani ovarectomizaţi, simvastatina are efecte benefice asupra vindecării osului osteoporotic din jurul implantului de titan, introdus postfractură proximală la nivelul tibiei. În acest caz, simvastatina a fost administrată per os, 5 mg/kg pe zi. Pentru obţinerea rezultatelor au fost folosite diferite metode histologice calitative şi cantitative. Acest studiu a avut numeroase concluzii importante privind efectele simvastatinei: 1) a indus o creştere semnificativă a densităţii minerale osoase din jurul implantului; 2) a inhibat efectele negative ale osteoporozei asupra osteointegrării; 3) a favorizat vindecarea osoasă din jurul implantului de titan, crescând volumul osului trabecular, astfel îmbunătăţind legătura dintre os şi implant, obţinându-se o stabilitate secundară. Conform acestor concluzii, simvastatina are un efect benefic asupra vindecării osului osteoporotic, ceea ce subliniază efectul anabolic al acesteia asupra metabolismului osos(10).

Este foarte important de menţionat faptul că titanul, ca material de implant, are şi el efecte benefice asupra osteogenezei. În particular, s-a demonstrat că unele nanostructuri de pe suprafaţa implantului de titan intensifică diferenţierea osteoblastică a celulelor stem mezenchimale(11).

Un alt studiu(12) efectuat pe şobolani ovarectomizaţi oferă o altă abordare. Metoda folosită în cadrul acestuia constă în fracturarea tibiei şobolanilor ovarectomizaţi, urmând ca după aceea să fie trataţi cu simvastatină. În acest caz, medicamentul (soluţie de simvastatină 5% diluată) a fost injectat subcutanat în ţesuturile din imediata vecinătate a fracturii. Rezultatele au fost promiţătoare, calusul cartilaginos fiind vizibil la o săptămână după fractură în grupul tratat cu simvastatină(12). Există însă limitări în cazul acestui studiu. În primul rând, medicamentul a fost administrat într-o doză mult mai mare decât cea normală, astfel că aplicabilitatea clinică este nerealizabilă. În al doilea rând, medicamentul a fost administrat local, prin injectare, aceasta fiind o abordare invazivă, ce creşte posibilitatea apariţiei unor complicaţii locale.

Ceea ce trebuie să observăm este faptul că cele două studii prezentate anterior se refereau la procesul de calusare realizat la nivelul extremităţii proximale a tibiei, caz în care se poate vorbi despre un ţesut osos preponderent trabecular. Comportamentul diferit al statinei la nivelul ţesutului osos trabecular faţă de cel compact a fost evidenţiat în studii care au urmărit porozitatea osului şi evoluţia grosimii trabeculelor osoase prin relaxometrie RMN(13).

Un alt studiu(14) efectuat pe şobolani ovarectomizaţi a urmărit procesul de calusare al fracturii me­­dio­dia­fizare femurale la şobolani trataţi cu simvas­ta­tină, urmărind efectul medicaţiei prin prisma a două metode de administrare, locală şi per os. Concluziile aces­tui studiu dovedesc efectul benefic al simvastatinei, fiind însă o diferenţă între metodele de adminis­tra­re a medicamentului, vindecarea având loc mult mai repede în cazul grupului tratat cu simvastatină per os.

Având în vedere că unele studii urmăresc procesul de calusare la nivelul osului cortical (diafizar)(9), altele la nivelul celui trabecular, iar dozele diferă în cadrul acestora(10,11), este posibil ca studiile să nu fie concordante, deoarece se urmăreşte efectul pe structuri osoase cu organizare diferită.

Creşterea importanţei şi relevanţei studiilor se poate realiza prin urmărirea concomitentă a efectelor diverselor medicaţii atât asupra ţesutului osos cortical, cât şi trabecular(15), ştiindu-se faptul că fracturile osteoporotice spontane apar la nivelul osului trabecular (tasări de corpi vertebrali), în timp ce fracturile diafizare, femurale şi radiale apar după traumatisme minore.

Concluzii

Simvastatina favorizează procesul de calusare atât în cazul grupului ovarectomizat, cât şi în cazul celui neovarectomizat, însă efectul benefic al simvastatinei asupra procesului de calusare este potenţat de prezenţa estrogenilor.

O evaluare obiectivă asupra procesului de calusare trebuie să aibă în vedere nu doar formarea de ţesut osos, ci şi activitatea celulară, deoarece vindecarea osoasă nu este dependentă doar de cantitatea de ţesut osos, ci şi de gradul său de structurare.

Cantitatea aproximativ egală de ţesut osos, în cadrul celor 4 loturi, la finalul celor 8 săptămâni de studiu, arată că acest interval este suficient pentru evaluarea procesului de calusare al fracturilor femurale la şobolani.

Conflict of interests: The authors declare no conflict of interests.

Bibliografie

  1. Kanis JA, Cooper C, Rizzoli R, Reginster JY. European guidance for the diagnosis and management of osteoporosis in postmenopausal women. Osteoporos Int. 2019; 30:3-44.

  2. Beers MH, Porter RS. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Ed. ALL, Bucureşti, 2009; 4(36): 305-308.

  3. Dobbs MB, Buckwalter J, Saltzman C. Osteoporosis: the increasing role of the orthopaedist. The Iowa Orthopaedic Journal. 1999;19:43-52.

  4. Kanis JA. Assessment of osteoporosis at the primary health-care level. Technical Report. World Health Organization Collaborating Centre for Metabolic Bone Diseases, University of Sheffield, UK. 2007.

  5. Chow J, Tobias JH, Colston KW, Chambers TJ. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorbtion but also by stimulation of bone formation. J Clin Invest. 1992; 89(1):74-8.

  6. Kanis AJ. Diagnosis of osteoporosis and assessment of fracture risk. Lancet. 2002; 359: 1929-1936.

  7. Wong SK, Chin KY, Suhaimi FH et al. The Relationship between Metabolic Syndrome and Osteoporosis: A Review. Nutrients. 2016; 8,347.

  8. Palinski W. New Evidence for Beneficial Effects of Statins Unrelated to Lipid Lowering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2001; 21:3-5.

  9. Oxlund H, Andreassen TT. Simvastatin treatment partially prevents ovariec­to­my-induced bone loss while increasing cortical bone formation. Bone. 2004; 34:609-618.

  10. Du Z, Chen J, Yan F, Xiao Y. Effects of Simvastatin on bone healing around titanium implants in osteoporotic rats. Clin. Oral Impl. Res. 2009; 20:145-150.

  11. Salou L, Hoornaert A, Louarn G, Layrolle P. Enhanced osseointegration of titanium implants with nanostructured surfaces: an experimental study in rabbits. Acta Biomaterialia. 2015; 11:494-502.

  12. Wang JW, Xu SW, Yang DS et al. Locally applied simvastatin promotes fracture healing in ovarectomized rat. Osteoporos Int. 2017; 18: 1641-1650.

  13. Şipoş RS, Fechete R et al. Ovarectomized ratsfemur treated with fibrates and statins. Assessment of pore-size distribution by H-NMR relaxometry. Rom J Morphol Embryol. 2015; 56(2): 743-752.

  14. Şipoş RS, Pap Z, Szalai AS et al. Statins - Possible Double Potential in Public Health policies. Acta Medica Marisiensis. 2010; 56(5):479-483.

  15. Şipoş RS, Fechete R, Moldovan D et al. Ovarectomy Induced Osteoporosis Evaluated by H One-and Two-Dimensional NMR Transverse Relaxometry. Appl Magn Reson. 2016; 47:1419-1437.

Articole din ediţiile anterioare

SUPLIMENT REUMATOLOGIE | Ediţia 2 122 / 2018

Efectele secundare posibile ale tratamentului cu bifosfonaţi la pacientele cu osteoporoză post-menopauză: dereglarea homeostaziei osoase şi osteonecroza de mandibulă

Rodica Tănăsescu

Odată cu creşterea speranţei de viaţă, patologia osteoporotică a devenit extrem de frecventă. Riscul crescut de fractură a de­ter­minat un interes ...

29 aprilie 2018
SUPLIMENT REUMATOLOGIE | Ediţia 2 122 / 2018

Actualităţi în osteoporoză

Şef lucrări dr. Mihaela Daniela Baltă

Osteoporoza este o afecţiune tot mai frecventă în ultimii ani, din cauza procesului de îmbătrânire a populaţiei. Afecţiunea fragilizează oasele şi ...

29 aprilie 2018
SUPLIMENT REUMATOLOGIE | Ediţia 2 122 / 2018

Efectele tratamentului cu bifosfonaţi asupra remodelării microarhitecturii corticale osoase la pacientele cu osteoporoză post-menopauză – cercetări morfologice, clinice şi experimentale

Rodica Tănăsescu

inamica remodelării microarhitecturii osoase corticale este evidenţiată cu acurateţe prin utilizarea spectrelor de absorbţie în infraroşu, oferind ...

29 aprilie 2018