Implementarea unui protocol de tip Real‑Time PCR HRM pentru diagnosticul mielopatiei degenerative la câine

Introducere

Scleroza amiotrofică laterală (ALS – Amyotrophic lateral sclerosis) la om este definită ca fiind un grup eterogen de boli care apar la indivizii adulţi, având ca rezultat fenomene neurodegenerative cu un caracter progresiv, cu exprimare clinică stadială plecând de la slăbirea forţei musculare până la fenomene de paralizie cu diferite grade de severitate şi, în ultim stadiu, moarte. Epidemiologic, 5% până la 10% dintre cazurile de ALS sunt de tip familial, iar dintre acestea aproximativ 20% au drept cauză mutaţii la nivelul genei SOD1 (superoxid dismutaza 1)^(2,6,7).

Relativ recent⁽¹⁾, o mutaţie similară a fost descrisă şi la unele rase de câini şi tot la nivelul genei SOD1, responsabilă de demielinizarea axonilor şi, consecutiv, de fenomene clinice anterior amintite. Mai exact, este vorba despre o boală autozomală recesivă cu penetrabilitate incompletă, cauzată de tranziţia (c.118G>A) la nivel de exon 2 şi, consecutiv, înlocuirea glutamatului cu lizină în poziţia 40 a lanţului polipeptidic^(1,3).

Până în prezent, numeroase tehnici au fost descrise pentru diagnosticul mutaţiei genei SOD1 la câine, plecând de la standardul de aur în biologia moleculară – secvenţiere⁽¹⁾ până la tehnici de tipul PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)⁽³⁾, pirosecvenţiere, Real‑Time PCR utilizând sonde de tip MGB (minor groove binding)^(4,5). Conform autorilor, fiecare dintre aceste tehnici este capabilă să identifice evenimentul genetic cauzal, totuşi în practică există unele limitări legate de implementarea unui astfel de test, fiind necesar un laborator de specialitate echipat cu aparatură performantă şi costisitoare (secvenţiere ADN), flux de lucru laborios şi costisitor (PCR-RFLP) sau accesibilitatea şi costul unor reagenţi (Real‑Time PCR cu sonde MGB).

În lucrarea de faţă este descris un flux de lucru capabil să contracareze majoritatea neajunsurilor anterior amintite, fiind utilizată o tehnică ce are un cost redus comparativ cu celelalte (Real‑Time PCR HRM), amplificarea şi detecţia fiind efectuate într-un singur tub de reacţie şi care nu necesită postprocesare.

Extracţia ADN‑ului genomic

Extracţia ADN‑ului genomic a fost efectuată din mai multe categorii de probe biologice, fiind prelevate tampoane gingivale, sânge integral recoltat pe EDTA şi tampoane rectale. Indiferent de tipul de matrice biologică, a fost utilizat un kit comercial dedicat (QIAamp DNA Mini Kit – Qiagen, Hilden, Germania), conform protocolului recomandat de producător, cu mici modificări în ceea ce priveşte volumele reagenţilor şi numărul etapelor de spălare coloniţe de purificare (modificări disponibile la cerere), cu eluţia ADN într‑un volum final de 150 µl.

Amplificarea regiunii genice de interes

Etapa de amplificare a presupus utilizarea de primeri specifici care să amplifice un fragment de 56 de nucleotide (M.A. Turcitu, nepublicat) utilizând kitul specific (Type-it HRM PCR Kit – Qiagen, Hilden, Germania) şi aparatul RotorGene Q model 5plex HRM (Qiagen, Hilden, Germania). Fluorescenţa a fost colectată la finalul fiecărui ciclu, cu generarea curbelor de amplificare de către aparat (figura 1).
 

Etapa HRM

Ulterior etapei de amplificare Real‑Time PCR, probele au fost supuse analizei HRM cu următorul profil termic: creşterea progresivă a temperaturii de la 75°C la 85°C cu un increment de 0,1°C şi colectarea continuă a fluorescenţei. Consecutiv acestei etape, au fost obţinute curbele de topire specifice (figura 2).
 

După terminarea experimentului, cu ajutorul softului dedicat au fost obţinute genotipurile aşteptate prin utilizarea algoritmilor specifici (figura 3).
 

Validarea rezultatelor

Aceasta a fost efectuată prin analiza unor pacienţi analizaţi anterior pentru mutaţia SOD1 de către un laborator acreditat ISAG (International Society of Animal Genetics), din rasa Ciobănesc Australian, prin analiza comparativă a unui număr de 27 de indivizi din toate cele trei categorii posibile (opt indivizi homozigoţi sălbatic, nouă heterozigoţi, zece homozigoţi mutant). Rezultatele obţinute au avut o concordanţă de 100%.