Performanţele testelor de biologie moleculară în diagnosticul parvovirozei canine

Introducere

Testele de biologie moleculară reprezintă cronologic cele mai noi și mai moderne tehnici de investigare, inclusiv pentru identificarea și caracterizarea agenților patogeni, precum și a bolilor cu transmitere genetică.

În anul 1989, revista „Science” selecta tehnica PCR ca fiind una dintre cele mai importante descoperiri științifice, iar enzima-cheie implicată în această reacție, Taq-polimeraza, era desemnată ca „molecula anului”. Patru ani mai târziu, Kary Mullis obținea Premiul Nobel pentru Chimie⁽⁶⁾.

Astfel, începuturile PCR eliminau limitările în pri­vin­ța determinării calitative (ulterior și cantitative) a agenților infecțioși și nu numai, atât în domeniul cercetării, cât și în privința diagnosticului⁽⁵⁾.

În prezent este dificil de găsit o publicație unde rezultatele obținute să nu se bazeze într-un mod sau altul pe reacția PCR^(2,6).

Totuși, pentru a înțelege pe deplin rolul și locul acestui test în diagnostic, precum și modalitatea de interpretare și coroborare a rezultatelor cu statusul infecțios/imun al animalului, se impun înțelegerea mecanismului de acțiune și valoarea de diagnostic a rezultatelor.

Rezumativ, atât din punct de vedere tehnic, cât și din punct de vedere practic, se poate afirma cu privire la tehnica PCR că beneficiază de următoarele avantaje:

n Reprezintă o reacție enzimatică de tip ciclic, fiind considerată un adevărat xerox biologic ce pornește de la câteva copii de ADN al agentului patogen ce se dorește a fi evidențiat și ajunge la sinteza a miliarde de astfel de copii.

• Specificitate înaltă - această caracteristică este dată de secvența primerilor, o secvență de nucleotide specifică și unică, astfel că din multitudinea de categorii de ADN purificate (așa cum aminteam anterior, ADN genomic propriu speciei de la care s-a prelevat proba, ADN viral, bacterian, parazitar, fungic etc.) este amplificat strict cel al agentului infecțios de interes.
• Sensibilitate înaltă - prin amplificarea ex­po­nen­țială se ajunge la o capacitate de detecție extrem de ridicată, de neegalat în opinia autorului.
• Flexibilitate înaltă - această caracteristică se referă în special la multitudinea de tipuri de probă biologică ce poate fi analizată, inclusiv lichide biologice și patologice, diferite tipuri de țesuturi și organe, secreții și excreții biologice și patologice, tampoane de prelevare etc.

Performanțele PCR - studii comparative:

Există numeroase comunicări din domeniul medicinei umane și veterinare în care sunt raportate performanțele de diagnostic ale acestui test, inclusiv pentru animalele de companie.

În continuare vor fi prezentate câteva exemple pe care le consider elocvente atât datorită complexității studiilor, dar și având în vedere cazuistica regăsită în practică pentru această entitate nosologică - parvoviroza canină.

1. Parvoviroza canină - PCR versus testele rapide detecție antigen:

Studiul intitulat „Comparison of three rapid commercial Canine parvovirus antigen detection tests with electron microscopy and polymerase chain reaction” a fost realizat în anul 2009 de către o echipă din Germania⁽⁴⁾ și a fost structurat după cum urmează:

• au fost realizate trei grupe de pacienți în funcție de criterii clinice, astfel: grupul A - câini cu semne clinice de diaree hemoragică acută (50 de pacienți); grupul B - câini cu semne clinice de diaree cronică (10 pacienți) și grupul C - fără antecedente/semne clinice de enterită (40 de pacienți);
• s-au utilizat trei teste rapide, astfel: SNAP parvo antigen test - Idexx Laboratories; FASTest - Scil Animal Care Company; Witness parvo card - Selectavet.

Rezultatele obținute sunt prezentate sub formă centralizată în tabelul 1.

Discuții și interpretări: După cum se poate observa, pentru grupul A (câini cu semne clinice de diaree hemoragică acută), care se poate considera că aparține din punct de vedere patogenetic perioadei în care încărcătura antigenică (virală) este maximă, testul rapid comercializat cu preponderență în România (SNAP parvo antigen test - Idexx) a fost capabil să identifice un număr de trei ori mai mic de cazuri pozitive.

Referitor la grupul B (câini cu semne clinice de diaree cronică), care se poate considera că aparține din punct de vedere epidemiologic cel mai probabil stării de purtător și eliminator, nici unul dintre testele rapide nu s-a pozitivat, comparativ cu testul PCR la care s-a reușit identificarea unui caz.

Nu în ultimul rând, pentru grupul C (fără antecedente/semne clinice de enterită), care din punct de vedere epidemiologic se poate încadra în perioada de debut a bolii (incubație) sau, dimpotrivă, în perioada de purtător/eliminator, iar patogenetic poate fi atribuit inclusiv unor pacienți asimptomatici și/sau cu semne clinice puțin relevante, nici unul dintre testele rapide nu s-a pozitivat, comparativ cu testul PCR la care s-a reușit identificarea a cinci cazuri.

Așadar, rezumativ, se pot desprinde următoarele idei principale de la nivelul acestui studiu:

• sensibilitatea comparativă a testelor rapide raportată la testul PCR a fost de numai 18,4% pentru SNAP parvo antigen test, 15,8% pentru FASTest și 26,3% pentru Witness parvo card;
• specificitatea testelor rapide a fost de 100% pentru SNAP parvo antigen test și FASTest, în timp ce pentru Witness parvo card a fost de numai 95,2%. Așadar, există o relație de invers-proporționalitate între sensibilitate și specificitate pentru aceste teste rapide - o specificitate înaltă conduce la scăderea sensibilității și viceversa.

2. Parvoviroza canină - PCR versus metodologii de diagnostic virusologic convențional versus teste rapide:

Studiul a fost realizat în anul 2005 de către o echipă aparținând Facultății de Medicină Veterinară din Bari, Italia⁽¹⁾, și a fost structurat după cum urmează:

• s-au recoltat probe de fecale de la 89 de pacienți cu semne clinice de enterită;
• s-au utilizat tehnici de virusologie consacrate, și anume reacția de hemaglutinare și virus-izolarea;
• s-au utilizat tehnicile rapide de detecție antigen - SNAP parvo antigen test - Idexx Laboratories;
• s-au utilizat două metodologii PCR, și anume cea convențională și cea în timp real (Real Time PCR).

Rezultatele obținute sunt prezentate sub formă centralizată în tabelul 2.

Discuții și interpretări. La fel ca și în cazul primului studiu, sensibilitatea testelor rapide a fost net inferioară față de cea a PCR. În mod surprinzător, reacția de hemaglutinare s-a dovedit a avea o sensibilitate destul de mare, fapt confirmat și de alte raportări din domeniu. Totuși, indiferent de testul virusologic clasic utilizat, sensibilitatea PCR atât în varianta convențională, dar mai ales Real Time a fost de neegalat.

Concluzii

Luând ca exemplu diagnosticul parvovirozei, testele PCR se dovedesc a fi extrem de sensibile în comparație atât cu testele convenționale de identificare antigen și în special cu cele imunocromatografice (testele rapide) (figura 1).

Așadar, dacă se ține cont de etiopatogeneză și încărcătura virală existentă la un moment dat în organismul infectat, relevanța în utilizare pentru diferitele teste de identificare virus din fecale este următoarea (Tabelul 3):

1) Testele rapide sunt capabile de identificarea antigenului strict în perioada titrului viral maxim, care din punct de vedere patogenetic corespunde apogeului perioadei de exprimare clinică a bolii (începând din ziua 6 până în ziua 10-11 post-infecție), fiind total inadecvate în perioada preclinică (incubație), debutul perioadei clinice (ziua 4 - ziua 6) și perioadei de remisie clinică/stării de purtător;

2) Virus izolarea se dovedește a fi un test relevant pentru identificare aproximativ pe toată perioada de exprimare clinică a bolii, fiind totuși posibilă o pozitivare și în cazul fazei de debut si de remisie, prin creșterea numărului de pasaje. Totuși, având în vedere fluxul de lucru destul de laborios și perioada mare de obținere a rezultatelor (o medie de 7-10 zile), consider că rolul de diagnostic al testului este unul extrem de limitat, motivația utilizării fiind mai degrabă stabilirea unei colecții virale ce poate fi ulterior utilizată în scopuri de cercetare;

3) Microscopia electronică datorită prețului de cost al echipamentelor, metodologiei de pregătire a probei pentru analiză, numărului de probe procesate în unitatea de timp și perioadei considerabile de instruire a personalului nu este (deocamdată) utilizată în scopuri de diagnostic curent;

4) Testul PCR convențional se dovedește extrem de relevant pentru detecția calitativă a virusului indiferent de dinamica titrului viral (incubație/exprimare clinică/remisie/fază cronică)⁽³⁾. Așadar, se poate discuta de un test capabil să satisfacă maximul posibil în ceea ce privește sensibilitatea. Legat de rapiditatea în obținerea rezultatelor, acestea pot fi teoretic generate în aceiași zi, totuși în opinia autorului un termen realist de procesare probe și interpretare rezultate ar fi 48-72 ore datorită fluxului de diagnostic ce implică cerințe specifice pentru prevenirea generării de rezultate fals-negative dar mai ales fals-pozitive. Mai mult, atunci când este posibil, prin completarea rezultatelor cu teste serologice pentru detecția anticorpilor specifici, se poate face o discriminare extrem de utilă între faza de debut a bolii (antigen pozitiv/anticorp negativ) și cea de cronicizare (antigen pozitiv/anticorp pozitiv), informație extrem de prețioasă în managementul clinic și/sau epidemiologic al bolii;

5) Testul PCR în timp real, pe lângă avantajele descrise pentru varianta convențională, permite o estimare exactă a încărcăturii virale, putând fi astfel utilizat pentru monitorizarea în dinamică a bolii (figura 2).