Neuroştiinţe: domenii de studiu, interdisciplinaritate şi tehnici folosite

Neuroştiinţele reprezintă „studiul ştiinţific al sistemului nervos“ (conform Merriam-Webster Medical Dictionary⁽¹⁾), „studiul anatomiei, fiziologiei, biochimiei şi farmacologiei sistemului nervos“ (conform Collins English Dictionary⁽²⁾) sau „ştiinţa care se ocupă cu studiul sistemului sau al funcţiei sistemului nervos sau al creierului“ (conform Georgetown University Medical Center⁽³⁾). Ca atare, neuroştiinţele prezintă o definiţie omogenă, majoritatea surselor de specialitate, atât medicale, cât şi non-medicale, prezentând o definiţie similară. Totuşi, neuroştiinţele prezintă numeroase ramuri, existând numeroase conexiuni între acestea (tabelul 1).

Deşi iniţial neuroştiinţele au reprezentat o ramură a biologiei, la ora actuală sunt considerate o ştiinţă interdisciplinară care este strâns legată cu chimia, fizica, matematica, ştiinţa calculatoarelor, ingineria, lingvistica, psihologia, neuroeducaţia, neurodreptul, filosofia, neuroetica, medicina, genetica etc.⁽³⁾

Interdisciplinaritate

Numeroase alte discipline studiază neuroştiinţele sau folosesc studiul acestora pentru a face progrese în propriul domeniu de cercetare (tabelul 2).

Ştiinţa calculatoarelor (computer science) priveşte creierul drept un complex computer statistic, cu regiuni care pot fi considerate descentralizate, în care neuroni individuali se află într-o constantă evoluţie, stabilind noi sinapse, creând astfel căi computaţionale noi sau reorganizând căi deja existente. Identificarea proceselor responsabile pentru neuromotricitate şi neuroplasticitate poate duce la aplicarea de algoritmi non-lineari pentru dezvoltarea a numeroase aplicaţii ca, de exemplu, în statistical machine learning, unde pot fi folosiţi pentru a îmbunătăţi considerabil funcţii complexe ca perceptronul multistrat, o funcţie statistică care oferă predictibilitate şi specificitate individuală pentru unităţile unui sistem, spre deosebire de regresia lineară cu care nu se pot face decât predicţii generale^(4,36). Ingineria studiază neuroştiinţele pentru a putea reda sau îmbunătăţi capacităţile corpului uman prin interacţiuni directe între sistemul nervos şi aparate artificiale, dorind să realizeze înţelegerea codării şi procesării informaţiilor din cadrul diverselor sisteme senzoriale şi motorii din corpul uman. Se discută şi despre posibilitatea depăşirii obstacolelor determinate de cantitatea enormă de rezultate din domeniul neuroştiinţelor printr-o abordare „inginerească“, prin planificarea cu ajutorul „hărţilor de cercetare“⁽⁵⁾.  
 

Neuroeducaţia cercetează mecanismele neurale ale citirii, cogniţiei numerice, atenţiei etc., propunând o nouă abordare interdisciplinară a dislexiei, discalculiei, tulburării hiperkinetice cu deficit de atenţie (THDA)^(6-10) etc., în timp ce lingvistica studiază mecanismele neurale ale creierului uman care controlează înţelegerea, producerea şi dezvoltarea limbajului etc.⁽¹¹⁾  Neurodreptul studiază modul în care descoperirile din domeniul neuroştiinţelor afectează şi vor afecta sistemul legal⁽¹²⁾. Neurofilosofia studiază modificarea conceptelor filosofice de către domeniul neuroştiintelor în condiţiile în care dezvoltarea acestui domeniu a avut doar un impact minor asupra filosofiei până la ora actuală⁽¹²⁾, iar neuroetica studiază implicaţiile legale, etice şi sociale ale neuroştiinţelor, ca urmare a progreselor din domeniu ce au modificat idei clasice despre sine şi despre relaţia individului cu societatea⁽¹³⁾.

Tehnici folosite

Imagistica cerebrală

În cadrul imagisticii cerebrale se folosesc mai multe tehnici, precum rezonanţa magnetică nucleară funcţională (RMNf), tomografia cu emisie de pozitroni (positron emission tomography, PET), tomografia computerizată cu emisie de fotoni (Single-Proton Emission Computerized Tomography, SPECT), imagistica optică, magnetoencefalografia şi electroencefalografia (tabelul 3).

În imagistica cerebrală se studiază ipoteze precum:

• activitatea în regiunea cerebrală X se corelează cu stimulul/ sarcina Y;

• pentru un stimul/ sarcină, activitatea în zona X precede activitatea în zona Y;

• activitatea în zona X este mai mare în cazul condiţiei Y decât Z;

• activitatea în zona X este mai mare la populaţia Y decât la populaţia Z;

• activitatea în regiunea X se schimbă pe măsură ce subiectul învaţă sarcina.

Principalele designuri de studii întâlnite în imagistica cerebrală sunt:

• Design BLOCK, cu două categorii de stimuli ce sunt alternaţi (ex.: „feţe zâmbitoare“ şi „feţe neutre“).

• Design legat de eveniment (Event-Related Design) cu stimuli izolaţi, individuali (cu posibilă întoarcere la starea de bază între stimuli).

• Design mixt care combină cele două designuri anterioare.

 Rezonanţa magnetică nucleară funcţională măsoară parametrii legaţi de funcţiile fiziologice, precum schimbări în nivelurile unor produşi secundari metabolici, fluxul sangvin, volumul sangvin şi oxigenarea sângelui.

RMN-ul funcţional foloseşte semnalul BOLD (Blood Oxygenation Level Dependent)⁽¹⁵⁾ pornind de la faptul că neuronii nu prezintă rezerve de energie (carbohidraţi şi oxigen), ca atare activarea neuronală necesitând mai multă energie să ajungă la neuroni, şi sângele eliberând mai mult oxigen în neuronii activi decât în cei inactivi, rezultând o diferenţă de susceptibilitate magnetică între oxihemoglobină şi deoxihemoglobină care poate fi detectată folosind RMN. Prin numeroase măsurători repetate ale unui stări, metode statistice pot fi folosite pentru a afla care zone ale creierului prezintă cea mai mare diferenţă, deci care zone sunt cele mai active.

RMN-ul funcţional prezintă ca avantaje rezoluţia spaţială de sub 1 mm şi absenţa folosirii tracer‑ilor radioactivi, dar rezoluţia temporală, deşi este suficient de rapidă pentru a distinge între teste, permiţând randomizare, nu este suficient de rapidă pentru a distinge între modurile de activare asociate cu diferitele stadii ale procesării stimulului⁽¹⁴⁾.

Tomografia cu emisie de pozitroni este o tehnică imagistică funcţională, ce produce imagini tridimensionale ale proceselor funcţionale din corp. PET-ul prezintă următoarele etape⁽¹⁶⁾:

Un izotop radioactiv artificial, creat prin expunere la energii înalte într-un ciclotron, este injectat subiectului, acest izotop fiind anterior încorporat într-o moleculă activă biologic (ex.: fluorodeoxiglucoza, FDG).
 

După ce molecula a ajuns în ţesutul care se doreşte studiat, subiectul este plasat în scanner.

Ca urmare a iradierii, izotopul artificial se află într-o stare de dezintegrare b+ şi va emite pozitroni (particule de antimaterie cu încărcătura electrică opusă electronului, antielectroni).

Pozitronul traversează o distanţă scurtă (de obicei sub 1 mm) şi, când întâlneşte în organism un electron, se produce o reacţie de anihilare, ce va rezulta în emisia a doi fotoni gamma, care se vor deplasa în direcţii opuse.

Scannerul PET, care constă dintr-o serie de detectori de raze gamma aranjaţi în jurul capului subiectului, va detecta cei doi fotoni, care, deoarece se deplasează în direcţii opuse, vor permite localizarea punctului în care pozitronul a întâlnit electronul (locul unde molecula activă biologic – de exemplu FDG – a ajuns).

Ulterior, datele PET vor putea fi interpretate împreună cu o imagine de tomografie computerizată (TC) sau RMN pentru a prezenta date funcţionale (obţinute de PET) în context anatomic (oferit de TC sau RMN).

Tomografia cu emisie de pozitroni prezintă ca avantaje posibilitatea folosirii izotopilor care se leagă de anumiţi receptori şi posibilitatea combinării cu TC sau RMN pentru a prezenta date funcţionale în context anatomic. Limitările acesteia sunt rezoluţia temporală scăzută (4-8 secunde), rezoluţia spaţială mai joasă decât a RMN-ului funcţional şi faptul că nu studiază anatomia, ci doar funcţia⁽¹⁴⁾.

Tomografia computerizată cu emisie de fotoni (SPECT) este similară PET, fiind totuşi mai ieftină decât aceasta (ceea ce reprezintă principalul său avantaj), dezavantajele fiind asemănătoare cu cele ale PET.

Magnetoencefalografia măsoară modificările câmpurilor magnetice de la suprafaţa scalpului, care sunt produse de schimbări în activitatea electrică cerebrală, aproximativ 50.000 de neuroni fiind necesari (spre deosebire de EEG, care necesită milioane). Magnetoencefalografia reprezintă o soluţie de compromis, cu o rezoluţie temporală excelentă, dar cu o rezoluţie spaţială mai slabă decât celelalte tehnici imagistice (totuşi mai mare decât a EEG)⁽¹⁴⁾.

Imagistica optică permite obţinerea simultană a informaţiilor despre sursa activităţii neuronale, precum şi despre evoluţia în timp. În cadrul acestei tehnici, suprafaţa creierului este iluminată şi o parte a acestei lumini este reflectată de pe creier şi detectată de mai mulţi senzori. Schimbările în activitatea neuronală produc schimbări ale cantităţii de lumină care este absorbită, respectiv reflectată de către creier, detectând astfel, în mod indirect, schimbări în activitatea neuronală^(14,17,18).

Electrofiziologie

Electrofiziologia este o ramură şi a neuroştiinţelor care explorează activitatea electrică a neuronilor, investigând procesele moleculare şi celulare care controlează semnalizarea neuronală⁽¹⁹⁾. 

Într-un studiu electrofiziologic, un semnal este înregistrat de un microelectrod, ajungând ulterior la un amplificator care compară acest semnal cu cel înregistrat de către un electrod priză de pământ, trimiţând ulterior semnalul unui osciloscop şi unui computer. Numeroase alte echipamente pot fi necesare şi dorite de echipa de cercetare, în funcţie de natura studiului⁽¹⁴⁾.

În funcţie de plasarea electrodului care realizează înregistrarea semnalului electric, putem defini trei tipuri de înregistrări electrofiziologice:

• înregistrări extracelulare (electrodul este plasat în afara neuronului);

• înregistrări intracelulare (electrodul este plasat în interiorul neuronului);

• înregistrări patch-clamp (electrodul este plasat adiacent membranei).

Studiile electrofiziologice răspund unor întrebări diverse precum „cum poate un neuron să codeze informaţia în potenţiale de acţiune?“ sau „cum pot diverşi agenţi farmacologici, neurotransmiţători şi neuromodulatori, să influenţeze rata de descărcare a unui neuron?“ (pentru înregistrări extracelulare), „cum poate activitatea sau inactivitatea unui neuron să influenţeze potenţialele locale sau potenţialele de acţiune ale unui alt neuron?“ sau „cum pot diverşi agenţi farmacologici, neurotransmiţători şi neuromodulatori, să influenţeze potenţialele locale sau potenţialele de acţiune ale unui neuron?“ (pentru înregistrări intracelulare),  „cât de mult curent trece printr-un singur canal ionic?“ sau „cum pot concentraţiile ionice, diverşi agenţi farmacologici, neurotransmiţători şi neuromodulatori, să influenţeze trecerea curentului printr-un canal ionic sau la nivelul unei celule?“ (înregistrări patch-clamp)⁽¹⁴⁾.
 

Microscopia

Microscopia a rămas o unealtă-cheie în domeniul neuroştiinţelor. La ora actuală, microscopia permite studiul sistemului nervos la nivelul unor scale spaţiale şi la adâncimi şi volume mai mari ale ţesutului nervos (inclusiv la un nivel ultrastructural mai mic decât limita difracţiei optice). De asemenea, microscopia optică se poate realiza şi pe subiecţi vii la ora actuală^(14,20,21) (tabelul 4).

Microscopia permite, în domeniul neuroştiinţelor, investigarea morfologiei, tiparelor de expresie şi a conectivităţii celulare, precum şi vizualizarea activităţii electrice şi biochimice neuronale, dar şi observarea şi manipularea activităţii neuronale şi a funcţiilor proteinelor pentru studiul dinamic al celulelor, organelor şi chiar al unor întregi animale⁽¹⁴⁾.

La ora actuală există numeroase modalităţi de studiu dinamic al creierului prin tehnici de microscopie^(14,20-25):

• foto-activarea prin fotoconversie, care determină o creştere a intensităţii fluorescenţei unor anumiţi fluoroflori după stimularea cu lumină (ex. proteina verde fluorescentă (GFP) foto-activabilă, care devine fluorescentă după stimularea cu lumină ultravioletă);

• foto-activarea prin eliminarea unei substanţe inhibitoare ataşate unei molecule active de interes (photo-uncaging);

• coloranţi care îşi schimbă proprietăţile (de exemplu la expunerea la Calciu);

• manipularea optică a activităţii neurale;

Teste biochimice

Testele biochimice sunt folosite pentru studiul neurochimicalelor, inclusiv al neurotransmiţătorilor, şi a substanţelor psihofarmaceutice care influenţează funcţia neuronală. Astfel se pot studia plasticitatea corticală, neurogeneza, diferenţierea neuronală etc.^(14,26).

Un aspect important al studiului neuroştiinţelor prin intermediul testelor biochimice este cercetarea expresiei şi a semnalizării proteice. Proteinele sunt importante în cadrul tuturor celulelor, inclusiv al neuronilor, deoarece servesc la menţinerea formei, dimensiunii şi mărimii celulare, la reglarea transcripţiei şi a expresiei genetice, drept receptori şi neurotransmiţători şi drept enzime care asigură funcţiile metabolice şi fiziologice ale celulei.

O mare varietate de teste sunt folosite pentru⁽¹⁴⁾:

• investigarea expresiei proteice (Western Blot; WB), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), teste radioimunologice (RIA), tehnici de imunohistochimie (IHC) şi microscopie imunoelectronică (IEM));

• investigarea interacţiunilor dintre proteine (coimunoprecipitare (Co-IP) şi cromatografia de afinitate);

• investigarea interacţiunilor dintre proteine şi ADN (imunoprecipitarea cromatinei; ChIP);

•  investigarea modificărilor post-translaţionale ale aminoacizilor şi ale proteinelor (de exemplu anticorpi specifici modificărilor post-translaţionale).

Prin intermediul acestor numeroase teste biochimice se poate determina⁽¹⁴⁾:

• dacă o proteină este exprimată într-o populaţie celulară şi la ce nivel;

• dacă o proteină interacţionează cu alte proteine;

• ce modificări post-translaţionale poate primi o proteină şi ce proteine determină aceste modificări;

• dacă o proteină este capabilă să interacţioneze cu ADN-ul şi/ sau să regleze expresia genetică.

Neurogenetica

Neurogenetica studiază rolul geneticii în dezvoltarea şi funcţia sistemului nervos.

În studiul neurogeneticii se folosesc screening‑urile genetice care reprezintă o tehnică experimentală pentru a identifica şi selecta indivizi caracterizaţi de un anume fenotip în cadrul unei populaţii mutagenice⁽²⁷⁾.

Principalele tipuri de screening‑uri genetice folosite în neuroştiinţe la ora actuală sunt forward genetic screen, reverse genetic screen, screening‑urile in silico şi screening‑urile moleculare.

Forward genetic screens identifică gene importante pentru un fenotip biologic (care genă este necesară pentru un anume fenotip). Poate fi asemănată cu pescuitul (nu se ştie ce genă va fi „prinsă“)^(14,27). Reverse genetic screens identifică fenotipul determinat de o genă (care fenotip este produs de o genă). Poate fi asemănată cu „jocul de noroc“ (gena „câştigătoare“ pe care se bazează speranţele cercetătorului)^(14,27). Screening‑urile in silico identifică gene sau proteine folosind bioinformatica sau bazele de date genomice. Două astfel de in silico screens sunt BLAST^(28,29) (Basic Local Alignment Search Tool), care compară secvenţele nucleotidice din cadrul ADN sau secvenţele de aminoacizi din cadrul unei proteine cu toate celelalte astfel de secvenţe cunoscute şi Ensemble⁽³⁰⁾ care este asemănător cu BLAST, dar accentul este pus pe analiza genomică. Screening‑urile moleculare sunt reprezentate de ARN interference (ARNi) screening în cadrul căruia molecule de ARN inhibă expresia unor gene, în general prin distrugerea unor moleculare de ARNmesager (ARNm) specifice^(31,32) şi screening‑urile cu ajutorul sondelor microarray pentru ADN complementar (ADNc) în cadrul cărora ARN-ul mesager este extras dintr-o mostră şi revers-transcris pentru a produce ADNc care este marcat şi hibridizat pe un microarray care conţine mii de secvenţe posibil complementare, fiind astfel folosit pentru a detecta care secvenţă de ARNm era exprimată în mostra originală⁽³³⁾.

Folosirea acestor screening‑uri genetice este valorificată datorită tehnologiei ADN-ului recombinant. Astfel, pot fi manipulate genele şi proteinele pe care le codează prin alterarea secvenţelor ADN, copierea/ tăierea sau introducerea lor în noi moduri sau secvenţierea lor pentru a le confirma⁽³⁴⁾. Tehnologia ADN-ului recombinant este susţinută de posibilitatea de a crea şi de a folosi organisme transgenice şi mutante, de exemplu şoarecii transgenici. Aceştia sunt obţinuţi prin injectarea de ADN străin în unul dintre pronucleii unui ovocit fertilizat de şoarece, care este apoi transferat unei mame „adoptive“. Între 10% şi 30% dintre urmaşi vor conţine acest ADN străin⁽³⁵⁾.

Concluzie

Neuroştiinţele au cunoscut o explozie a ariilor de studiu şi a metodelor folosite în cercetare. Un număr enorm de alte domenii foarte variate (de la matematică şi fizică la filosofie şi lingvistică, la psihologie şi medicină) studiază diverse aspecte ale neuroştiinţelor. Chiar domeniul neuroştiinţelor a ajuns la ora actuală foarte variat, incluzând multe subdomenii care deseori prezintă arii de interes similare sau folosesc aceleaşi tehnici de lucru.

De asemenea, tehnicile folosite în neuroştiinţe care au fost prezentate sunt foarte numeroase, provenind din toate domeniile afiliate medicinei, precum genetica, biochimia, biofizica, imagistica, biologia celulară şi moleculară etc.

Probabil în viitor vom putea observa o şi mai mare dezvoltare a neuroştiinţelor, atât din punctul de vedere al rezultatelor ştiinţifice, cât şi al îmbunătăţirii tehnicilor de lucru sau al dezvoltării sau adaptării unor alte tehnici pentru a putea depăşi actualele dezavantaje.