Eliminarea genomului HIV-1 din limfocitele T umane cu ajutorul complexului CRISPR/Cas9

Sindromul Imunodeficienţei Umane Dobândite (SIDA) rămâne o problemă severă de sănătate publică, 35 de milioane de oameni fiind infectaţi cu virusul imunodeficienţei umane, subtipul 1 (HIV-1). Cu toate că terapia antiretrovirală controlează eficient viremia la pacienţii infectaţi cu HIV-1, aceasta nu poate elimina HIV-1 din limfocitele T infectate aflate în stare latentă, care nu produc virioni progeni. Astfel, tratamentul pentru infecţiile cu HIV-1 trebuie să includă eliminarea directă a ADN-ului proviral din celulele infectate şi protejarea împotriva unei viitoare infecţii, fără a cauza leziuni ADN-ului celulei-gazdă.

Sistemul CRISPR/Cas9 (clustered, regularly-interspaced, short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 nuclease) are utilitate extinsă în editarea genetică, fiind implicat în numeroase studii asupra unor boli umane. Recent, sistemul CRISPR/Cas9 a fost modificat pentru a putea recunoaşte secvenţe de ADN specifice de la nivelul secvenţei lungi terminale repetitive (LTR) din cadrul genomului HIV-1. În acest mod, este posibilă excizia copiilor de ADN proviral integrate în genomul limfocitelor T umane. Rezultatele indică posibilitatea utilizării terapeutice a acestei tehnici de editare genetică, cu scopul eradicării HIV-1 din rezervoarele virale pentru a preveni dezvoltarea SIDA.

S-a folosit linia celulară 2D10 de limfocite T infectate cu HIV-1, dar din care lipseau gene structurale (pentru proteinele Gag şi Pol), iar gena pentru proteina accesorie răspunzătoare de eliberarea virionilor progeni (Nef) era înlocuită cu un marker fluorescent. Tratamentul acestei linii celulare cu Cas9, dar nu şi cu gARN (guideARN – secvenţă complementară cu porţiunea de ADN ce va fi editată) a dus la producţia de proteine virale şi marker fluorescent în peste 90% dintre celulele tratate, în timp ce coexpresia Cas9 şi gARN a inhibat expresia genelor HIV-1 şi a markerului fluorescent.

S-a efectuat secvenţierea întregului genom al celulelor 2D10 pentru a localiza cu exactitate situsurile în care ADN-ul proviral se integrează în ADN-ul limfocitelor T umane. Analiza PCR efectuată asupra celulelor 2D10 care exprimă Cas9, dar nu gARN, a arătat prezenţa unui fragment ADN de 6130 pb, corespunzând genomului HIV-1 integrat, flancat de o secvenţă de ADN a celulei-gazdă. În celulele tratate cu Cas9/gARN, a fost eliminat întregul ADN proviral mărginit de cele două LTR. Situsurile de clivare 5’LTR şi 3’LTR au fost unite de către ADN-ul celulei-gazdă. Există, aşadar, argumente puternice care susţin eliminarea eficientă a multiplelor copii de ADN proviral localizate în cromozomii 1 şi 16. Secvenţierea genică a arătat numeroase mutaţii apărute în mod natural în celulele cărora li s-a excizat ADN-ul proviral, însă niciuna nu a fost determinată de sistemul de editare genică, întrucât nu s-a identificat nicio secvenţă complementară cu gARN.

Metoda utilizată nu a arătat niciun impact asupra viabilităţii şi ciclului replicativ al celulelor şi nu a indus apoptoza, sugerând siguranţa utilizării în această fază. A fost demonstrat faptul că expresia Cas9 şi gARN a scăzut după câteva pasaje celulare şi eventual a dispărut complet, însă cât timp Cas9 şi gARN au fost prezente, celulele au fost protejate împotriva unei noi infecţii cu HIV-1.

După ce experimentul cu linia celulară 2D10 a arătat excizia completă a ADN-ului proviral HIV-1 şi lipsa oricărei modificări la nivelul ADN-ului celulei-gazdă, interesul cercetătorilor se îndreaptă către utilizarea sistemului CRISPR/Cas9 în culturi celulare primare şi chiar la probe provenite de la pacienţi, scopul final fiind implementarea unei terapii umane care să vizeze limfocitele T infectate cu HIV-1.