Tehnici de editare genetică în tratamentul infecţiei cu HIV

Editarea genetică presupune inserția, deleția sau înlocuirea unei porțiuni de ADN, utilizând nucleaze sintetizate în laborator (artificiale), cunoscute sub denumirea de „foarfece moleculare“⁽¹⁾. În momentul actual există trei tipuri de asemenea „foarfece moleculare“, în ordinea apariției: ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) și CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)⁽¹⁾. De-a lungul timpului, cercetătorii au încercat utilizarea fiecăruia dintre cele trei sisteme de editare genetică pentru a trata și chiar a vindeca infecția cu HIV⁽¹⁾.

ZFN sunt formate din două domenii, unul care recunoaște triplete de nucleotide din secvențe de ADN specifice (ZFP – Zinc Finger Proteins) și unul cu activitate nucleazică nespecifică (FokI), care clivează ADN-ul dublu catenar⁽¹⁾. Astfel, sunt introduse puncte de clivare în molecula de ADN, pe care celula le va repara⁽¹⁾. În majoritatea cazurilor vor fi introduse mutații în gena respectivă, care vor duce la inactivarea acesteia⁽¹⁾. Astfel, se încearcă folosirea acestei tehnologii în inactivarea genei care codifică pentru coreceptorul pentru beta-chemokine (CCR5), coreceptor necesar tulpinilor HIV macrofagotrope (majoritare în infecțiile in vivo) pentru a pătrunde în organismul uman și a declanșa infecția. Cercetătorii au ales să editeze această genă din mai multe motive⁽¹⁾. În primul rând, există persoane homozigote pentru deleția de 32 de perechi de baze a genei CCR5 (delta 32/delta 32) care sunt rezistente la infecția cu HIV⁽¹⁾. Persoanele heterozigote pentru această deleție (delta 32) și care se infectează cu HIV prezintă o progresie mult mai lentă a infecției către stadiul terminal, Sindromul Imunodeficienței Umane Dobândite (SIDA)⁽¹⁾. Nu în ultimul rând, există un singur pacient, care suferea de leucemie mieloidă acută și infecție HIV-1, căruia i-au fost transplantate celule stem de la un donator homozigot pentru deleția delta 32 CCR5. În urma transplantului, pacientul a întrerupt terapia antiretrovirală, iar cantitatea de ARN HIV-1 și ADN proviral a fost nedetectabilă în diverse produse biologice⁽²⁾. Scopul studiului a fost de a induce artificial deleția homozigotă delta 32 CCR5 în limfocitele T CD4+ și ulterior de a infuza aceste celule la pacienții cu infecție cu HIV cronică și viremie nedetectabilă, aflați sub tratament antiretroviral⁽²⁾. Rezultatul a fost o creștere a numărului de limfocite T CD4+, persistența pe termen lung a limfocitelor T CD4+ modificate la nivelul genei CCR5 și neimunogenicitatea acestora⁽²⁾. După 2-4 săptămâni de la întreruperea tratamentului cu antiretrovirale însă, viremia a devenit detectabilă la 66,7% dintre pacienți⁽¹⁾.

TALEN au un mecanism de acțiune foarte asemănător cu cel al ZFN, însă au avantajul că fiecare domeniu efector (TALE) recunoaște un singur nucleotid⁽³⁾. Astfel, sinteza TALEN este mai facilă decât cea a ZFN, care erau capabile să recunoască doar triplete de nucleotide⁽³⁾. Au fost efectuate studii în care s-a încercat editarea genetică a celor doi coreceptori HIV, CCR5 și CXCR4 (coreceptorul pentru alfa-chemokine), precum și a proteinei p75, cu rol în facilitarea integrării ADN-ului proviral în genomul celulei-gazdă⁽³⁾. Cu toate acestea, au fost întâmpinate dificultăți care țin de mărimea acestui sistem de editare genetică, care pune probleme în găsirea unei modalități de a-l transloca în celula-gazdă, precum și imunogenicitatea acestuia, proteinele efectorii TALE provenind de la bacteria Xanthomonas⁽³⁾.

Cel mai recent sistem de editare genetică conceput este reprezentat de CRISPR/Cas9⁽⁴⁾. Acesta presupune editarea unei secvențe specifice de ADN de către endonucleaza Cas9, ghidată de o moleculă scurtă de ARN-ghid (guide ARN; gARN), complementară cu secvența care va fi excizată⁽⁴⁾. Acest sistem este superior celorlalte două prezentate anterior, deoarece recunoașterea secvenței specifice de ADN se face foarte simplu și eficient, pe baza complementarității bazelor azotate, cu ajutorul gARN, care poate fi sintetizat astfel încât să recunoască orice secvență de ADN.Eficiența transferului este net superioară tehnicilor ZFN și TALEN, în celula-țintă este introdus ARN care codifică pentru endonucleaza Cas9 și gARN și pot fi introduse mutații în mai multe gene în același timp, prin introducerea mai multor tipuri de gARN⁽⁴⁾. Se încearcă și prin această tehnică inactivarea genei CCR5 în limfocitele T CD4+. De asemenea, este investigată posibilitatea de a exciza ADN-ul proviral HIV-1 din celulele infectate, inclusiv din rezervoarele celulare, acolo unde ADN-ul proviral rămâne în stare dormantă, făcând astfel imposibilă vindecarea infecției⁽⁴⁾. S-au obținut rezultate optimiste atunci când tehnica a fost aplicată asupra șoarecilor transgenici HIV, dar și asupra liniilor celulare de limfocite T CD4+⁽⁴⁾. Cu toate acestea, există riscul ca sistemul CRISPR/Cas9 să introducă mutații în ADN-ul proviral care să îl facă imposibil de recunoscut și de excizat de către gARN și Cas9⁽⁴⁾. De asemenea, genomul HIV este constituit din aproximativ 10 kb, iar gARN poate recunoaște doar 20 bp, așadar sunt mii de situsuri la nivelul ADN-ului proviral din celulele infectate aflate în stare latentă⁽⁴⁾. Nu în ultimul rând, tehnica trebuie gândită în așa fel încât să poată fi folosită în toate celulele din organism care conțin ADN proviral, inclusiv în sanctuare celulare, cum ar fi sistemul nervos central⁽⁴⁾.

În concluzie, deși rezultatele inițiale sunt promițătoare, există încă suficiente obstacole care trebuie depășite pentru ca tehnologia editării genetice să își găsească utilitatea clinică. 

Conflict of interests: The author declares no conflict of interests.